蛋白质的化学修饰.pptVIP

3.2交联剂的类型几种常用的可裂解的化学交联试剂3.2交联剂的类型不可裂解交联剂:其与蛋白质交联后,形成比较稳定的交联桥,可以增强酶蛋白与载体之间的稳定性,在一般情况下是不可切断的。典型的例子是戊二醛,它具有两个反应活泼的醛基,可与蛋白质分子中的Lys-?-NH2发生作用,从而形成交联.常被用于酶和蛋白质固定化。2P-NH2+O=C-(CH2)3-C=OP-NH-CH-(CH2)3-CH-NH-PHHOHOH当蛋白质浓度很大时,交联剂也能形成分子间的交联键,使蛋白质对变性趋于稳定。01如Rajput等用戊二醛将胰蛋白酶和胰糜蛋白酶交联在一起。这种固定化的杂化酶的优点是，显著地降低了杂化酶中胰蛋白酶的自溶作用，同时也使反应器的体积大大缩小。01酶分子内的交联常可提高酶分子构象的稳定性，防止酶失活。因此，设法增加酶分子表面交联键的数目是酶固定化的方法之一。013.3交联剂的应用研究蛋白质的折叠:如用辛二亚氨酸二甲酯作用于齐聚体蛋白质,使在同一亚基内和多亚基间的Lys残基之间形成交联,再进行SDS,则可测定其分子量和亚基的数目,以阐明亚基的组合情况(如单体、二聚体还是三聚体等）。用交联剂还能测定蛋白质上残基间的距离。如用跨度为0.37~1.45nm的一系列亚氨酯交联糖原磷酸化酶b,再结合SDS系统测定出,在有效交联形成的四聚体上的两Lys残基间距离约为0.8nm。3.3交联剂的应用测定蛋白质亚基的量:主要内容01化学修饰的原理蛋白质侧链的修饰蛋白质肽链的交联蛋白质的位点专一性修饰化学修饰结果的解释蛋白质化学修饰的应用蛋白质化学修饰的局限性02蛋白质化学修饰试剂的专一性包括：试剂对被修饰的基团的专一性：如DTNB只与蛋白质分子中的Cys-SH发生作用，而不与其它任何基团发生作用；试剂对蛋白质分子中被修饰部位的专一性：如修饰剂只作用于酶的活性部位，或酶蛋白上的激素结合部位(受体)等位点.这类专一性化学修饰称为亲和标记或专一性的不可逆抑制作用.四、蛋白质的位点专一性修饰4.1亲和标记亲和标记是一类位点专一性的化学修饰,试剂(抑制剂)可专一性地标记于酶的活性部位上,使酶不可逆的失活。可分为两类:1.Ks型不可逆抑制作用这类抑制剂是根据底物的结构设计的,它具有和底物结构相似的结合基团,同时还有一个活泼的反应基团,能对活性部位侧链基团进行修饰反应,使酶不可逆地失活。其反应分两步:A.抑制剂与活性部位特异结合并发生反应;B.将标记基团共价连接于活性部位上。4.1.1Ks型不可逆抑制作用如：利用高碘酸氧化核苷酸标记蛋白质分子中嘌呤核苷酸结合部位。01这种修饰的特点:底物、竞争性抑制剂或配体应对修饰有保护作用;02修饰反应是定量定点的修饰。03His残基的咪唑基可通过N原子的烷基化或C原子的亲核取代来进行修饰。01光氧化:特异性低,除与His外,还与Met、Trp以及少量Tyr、Ser和Thr残基进行反应。常用试剂有：碱性亚甲蓝、玫瑰红。02焦碳酸二乙酯(DPC)是最常用的His残基的修饰试剂,在近中性时专一性较好,使His残基的咪唑基上1个N羧乙基化,并使得在240nm处的光吸收增加。在碱性条件下该取代反应是可逆的。032.5咪唑基的化学修饰0102酚与脂肪族羟基的化学修饰Tyr残基酚羟基的修饰或芳香环上的取代修饰。酚羟基的修饰一般是可逆的，一些甚至只能短暂的存在或在除去反应试剂后和纯化产品时可逆。简单的酯化反应是常用的方法，在弱碱性或羟胺溶液中就可重新生成酚羟基。芳香环取代则可以生成比较稳定的产物，较早使用的是碘化作用。在温和的条件下，碘会与His和Cys残基发生反应；在剧烈条件下，Trp和Met残基也会受到影响。四硝基甲烷(TNM)因反应的高度专一性和反应条件比较温和,已成为Tyr残基最常用的修饰试剂,它与Tyr残基发生反应生成离子化的发色基团3-硝基Tyr衍生物。Ser和Thr残基的专一性修饰研究的相对比较少它们的羟基一般都可被修饰酚羟基的修饰试剂所修饰，只是反应条件更严格些，而一旦反应，生成的产物比与酚羟基生成的产物稳定。典型的例子是Ser蛋白酶活性部位的Ser残基对酰化剂如DFP具有较高的反应性。122.6酚与脂肪族羟基的化学修饰2.6酚与脂肪族羟基的化学修饰别构抑制剂AMP对酶活性有明显保护作用Arg残基含1个强碱性的胍基，在结合带有阴离子底物的酶的活性部位中起重要作用。因Arg残基的强碱性，