酯酶与氧化酶.pptVIP

广义的胆碱酯酶包括乙酰胆碱酯酶（AChE)和狭义的胆碱酯酶(ChE)，两者化学性质不同，用酯来检测底物特异性时，乙酰胆碱酯酶能最快地促使乙酰胆碱分解，也能水解乙酰-β-基甲基胆碱，但不能水解苯甲酰胆碱，此酶能被高浓度的乙酰胆碱抑制。但胆碱酯酶却不同，乙酰胆碱浓度越高，越能被胆碱酯酶所分解。ChE还能水解苯甲酰胆碱，但不能水解乙酰-β-基甲基胆碱。乙酰胆碱+H2O胆碱+醋酸酯酰胆碱+H2O胆碱+羧酸AChEChE四、乙酰胆碱酯酶和胆碱酯酶(AcetylcholinesteraseandCholinestrase,AChEandChE)乙酰胆碱酯酶胆碱酯酶乙酰胆碱√（快）高浓度时抑制其活性√高浓度不抑制其活性乙酰-β-基甲基胆碱√－苯甲酰胆碱－√（快）长链脂肪酸胆碱－√（快）AChE和ChE的底物特异性（一）显示方法——亚铁氰化铜法乙酰胆碱盐若用四异丙基焦磷酰胺抑制胆碱酯酶，可单独显示乙酰胆碱酯酶。亚铁氰化铜亚铁氰化钾+Cu2+AChE铁氰化钾010302反应原理利用乙酰胆碱酯酶能将乙酰胆碱盐水解产生硫代胆碱，使铁氰化物还原为亚铁氰化物，再与铜离子结合形成亚铁氰化铜显色沉淀，证明酶活性的存在。硫代胆碱２、孵育液乙酰硫代胆碱碘盐 5mg0.1mol/L醋酸缓冲液pH5.5 6.5ml0.1mol/L(2.94%)柠檬酸钠 0.5ml30mmol/L(0.75%)CuSO4 1.0ml5mmol/L(0.164%)铁氰化钾 1.0ml蒸馏水 1.0ml乙酰胆碱碘盐完全溶解于醋酸缓冲液后，依次加入其它溶液，临用前不超过30分钟内配制，充分混匀，至溶液呈亮绿色，最终pH5.5。３、操作步骤新鲜组织恒冷箱切片；冷丙酮或10%福尔马林固定20-25min；蒸馏水洗；入孵育液37℃，１h；蒸馏水洗；甘油明胶封固。结果与评价乙酰胆碱酯酶和胆碱酯酶活性部位显棕色沉淀。Cu2+浓度太小易弥散，pH5-5.5，高于６易扩散。对照用四异丙基焦磷酰胺4mM(0.137%)0.2ml抑制胆碱酯酶显示乙酰胆碱酯酶；用毒扁豆碱硫酸酯3×10-5M代替蒸馏水，先将切片处理30分，水洗后入孵育液，则二种酶均被抑制呈阴性。(二）生物学意义胆碱酯酶的活性中心是丝氨酸。乙酰胆碱酯酶活性的强弱是神经细胞性质和功能的重要参考指标，亦是神经系统发生过程中的神经细胞分化的一个指标，所以在形态上将乙酰胆碱酯酶的组织化学显示作为胆碱能传递部位的标志。AChE是生物神经传导中的一种关键性的酶，在胆碱能突触间，该酶降解乙酰胆碱，终止神经递质对突触后膜的兴奋作用，保证神经信号在生物体内的正常传递。AChE与细胞凋亡有一定的关系。在细胞水平发现实验所用的各类细胞，正常状态没有AChE活性反应，一旦发生凋亡，都有AChE活性反应。用其特异的抑制剂可以抑制其活性反应。用RT-PCR方法证明了凋亡细胞有AChEmRNA的转录。加入其抑制剂石杉碱可降低凋亡基因的表达。乙酰胆碱酯酶主要分布于神经系统（大脑皮质中有AChE阳性的神经纤维，还存在于胆碱能神经元中）、神经肌肉接头处、红细胞等，而胆碱酯酶主要分布于血清、胰腺、唾液腺内。胆碱乙酰转移酶(cholineacetyltransferase,ChAc)此酶不属于羧酸酯水解酶，它是乙酰胆碱的合成酶。胆碱乙酰转移酶的强弱是胆碱能神经生理功能的标志，因此将ChAC确认为胆碱能神经的标志酶。胆碱乙酰转移酶可把乙酰胆碱辅酶A的乙酰基转移到胆碱分子上,合成乙酰胆碱。辅酶A被游离出来，辅酶A中的—SH被铅离子沉淀而显示酶的活性。乙酰辅酶A+胆碱乙酰胆碱+辅酶APb2+沉淀产物PbS↓硫化铵（一）显示方法——Burt法1、反应原理ChAc2、孵育液25mmol/LN-2-羟基乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸缓冲液（HEPES）pH6.04mmol/L胆碱（48.5mg/100ml缓冲液）2mmol/L乙酰胆碱辅酶A（16.2mg/100ml缓冲液）18mmol/L硝酸铅（59.6mg/100ml缓冲液）1mmol/LPhospholineiodide(乙酰胆碱酯酶抑制剂）（3.8mg/100ml缓冲液）最终pH值为6.0。3、操作步骤固定：8μm厚的冰冻切片在10%蔗糖和2%戊二醛的25mmol/LHEPES缓冲液（pH7.0）中固定5min；漂洗：用含10%蔗糖的HEPES缓冲液洗15min×3；孵育：切片入孵育液