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甘草次酸对RAS蛋白功能的调控及其抗炎效果

摘要

甘草是多年生草本豆科植物甘草的干燥根和根茎，其性平，味甘，可以清热解毒，祛痰止咳，补脾益气，是我国重要的大宗药材，被普遍使用。大量文献表明，甘草具有多种药理作用，包括抗炎、抗肿瘤等。甘草次酸是甘草中主要成分甘草酸的体内活性产物，是其发挥药效的物质基础，但目前关于甘草次酸抗炎机制的研究并不多，其发挥抗炎发挥抗炎作用的靶点和途径尚需进一步研究。

本文首先采用计算机反向分子对接等技术，对甘草次酸的靶点蛋白进行虚拟筛选，通过克隆表达纯化关键的靶点蛋白RAS，对甘草次酸与靶点蛋白的相互作用进行了研究，并使用BEAS-2B细胞实验验证了甘草次酸对RAS及下游信号通路的调控作用。主要研究内容及结果如下：

、使用计算机反向对接技术，借助PharmMapper数据库对甘草次酸的靶点蛋白进行虚拟筛选。结合Fit值进行排序，使用String10.0网站对候选前30种靶点蛋白进行相互作用分析，并筛选出主要的相关通路；最终分析筛选出RAS可能为甘草次酸发挥抗炎作用的靶点蛋白。在PDB数据库中下载RAS的pdb文件后通过Autodock4.0等软件进行分子对接，得到甘草次酸与RAS的结合能为-7.80kcal/mol。

、使用表面等离子共振技术（SPR）进一步验证甘草次酸与RAS蛋白的相互作用，结果表明甘草次酸与RAS蛋白的解离常数为30.45μmol/L，证明甘草次酸与RAS蛋白之间存在较强的相互作用关系。

、为了验证甘草次酸与RAS蛋白相互作用后起到抗炎与祛痰功效，我们对下游蛋白ERK的表达及其磷酸化水平进行了评价，结果表明甘草次酸能有效抑制JNK的磷酸化；此外，细胞实验表明甘草次酸干预后炎性因子IL-6的水平明显降低，同时黏蛋白MUC5AC的表达减少。以上结果证明了甘草次酸靶向RAS调控RAS/MAPK发挥抗炎的作用。

综上所述，本文通过虚拟筛选、分子对接和小分子及蛋白相互作用技术证实甘草次酸及RAS蛋白的相互作用，初步明确了甘草次酸通过靶向RAS蛋白发挥抗炎的作用机制。

关键词：甘草次酸；RAS；抗炎；MAPK信号通路。

目录

TOC\o1-3\h\z\u摘要 ii

目录 vi

第一章前言 1

一、 甘草次酸研究现状 1

二、 炎症及相关通路概述 2

(一) 、NF-κB信号通路 2

(二) 、MAPK信号通路 3

三、 RAS蛋白及其抑制剂的研究概况 4

四、 本研究涉及到的相关技术 5

(一) 、SPR技术 5

(二) 、WesternBlot 6

(三) 、计算机反向对接技术 6

第二章甘草次酸抗炎靶点蛋白的发现 7

一、 研究方法 7

(一) 、虚拟筛选 7

(二) 、相互作用分析 7

(三) 、分子对接 8

二、 实验结果 8

三、 本章小结 11

第三章RAS蛋白的表达纯化与甘草次酸相互作用的研究 12

一、 研究方法 12

(一) 、蛋白的表达与纯化 12

(二) 、SPR分析 13

二、 实验结果 13

三、 本章小结 14

第四章甘草次酸的抗炎作用验证 15

一、 研究方法 15

(一) 、IL-6与MUC5AC的检测 15

(二) 、P-ERK的测定 16

二、 实验结果 17

三、 本章小结 18

第五章总结与展望 20

参考文献 22

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第一章前言

甘草次酸研究现状

甘草是一种已知具有多种药理活性的草本植物，在中华传统医学中被普遍应用，有着“草药之祖”的美誉，其味甘性平，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药的功效，故也被称为“国老”。甘草含有多种药效成分，如甘草甜素、异黄酮等，已被证明具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤作用。[{{{C2C}}}]

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图SEQ图\*ARABIC1甘草次酸结构

甘草次酸是甘草中主要成分甘草酸的体内活性代谢产物，结构见图1，属于五环三萜类化合物，可细分为α、β两种亚型，前者是经合成得到，后者是甘草甜素水解后脱去两分子葡萄糖醛酸后的产物，其化学结构与肾上腺皮质激素相近，且两种异构体的作用并不完全相同（付奇远,成嘉琦,2022)。关于其抗炎活性的研究表明.18β-甘草次酸可显著抑制曲霉蛋白酶诱导的炎症介质的表达。此外.它对体内曲霉蛋白酶刺激引起的上皮炎症也有抑制作用(陈奇远,杨雨萱,2023)。[]研究证明这些抑制作用与线粒体活性氧/丝裂原活化蛋白激酶和解偶联蛋白-2(UCP