DB32T 3681-2019 小麦产毒镰刀菌种群分子分型技术规范.docxVIP

ICS65.020.01B16

DB32

江苏省地方标准DB32/T3681—2019

小麦产毒镰刀菌种群分子分型技术规范

Technicalspecificationformoleculartypingoftoxin-producingfusariumspeciesinwheat

2019-12-03发布2019-12-25实施

江苏省市场监督管理局发布

DB32/T3681—2019

I

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由江苏省农业科学院提出并归口。

本标准起草单位：江苏省农业科学院。

本标准主要起草人：邢宇俊、仇剑波、董飞、徐剑宏、史建荣、吴季荣、陆丹丹。

DB32/T3681—2019

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小麦产毒镰刀菌种群分子分型技术规范

1范围

本标准规定了小麦产毒镰刀菌种群以及产毒素化学型区分中镰刀菌DNA的提取、PCR扩增、电泳检测及结果判定方法和操作规范。

本标准适用于产毒镰刀菌种群及产毒化学类型的定性PCR检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.15食品安全国家标准食品微生物检验霉菌和酵母计数

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3原理

产毒镰刀菌经过提取DNA后，利用特异性区分引物，通过普通PCR判断该样品是否为禾谷镰刀菌或亚洲镰刀菌。根据关键特异基因Tri11来区分该样品是否产生3ADON、15ADON或者雪腐镰刀烯醇NIV化学型。

4试剂和材料

4.1水：应符合GB/T6682中一级水的规格。

4.2PDA培养基：按GB4789.15规定。

4.3CTAB缓冲液:55mmol/LCTAB、1400mmol/L氯化钠（NaCl）、20mmol/LEDTA、100mmol/LTris-HCl（pH8.0），121℃高压灭菌20min，储存于2℃~8℃。

4.4TE缓冲液。

4.5RNA酶溶液（5μg/μL）。

4.6蛋白酶K（20mg/mL）。

4.7Tri饱和酚。

4.8酚：三氯甲烷：异丙醇（25：24：1）；三氯甲烷：异戊醇（24：1）。

4.9异丙醇。

4.10区分禾谷镰刀菌和亚洲镰刀菌引物

Fg16F:5′-CTCCGGATATGTTGCGTCAA-3′

Fg16R:5′-GGTAGGTATCCGACATGGCAA-3′

预期亚洲镰刀菌扩增片段大小为497bp；预期禾谷镰刀菌扩增片段大小为410bp。

4.11区分3A-DON、5A-DON和NIV化学型引物

DB32/T3681—2019

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Tri11-CON:5′-GACTGCTCATGGAGACGCTG-3′

Tri11-3ADON:5′-TCCTCATGCTCGGTGGACTCG-3′Tri11-15ADON:5′-TGGTCCAGTTGTCCGTATT-3′

Tri11-NIV:5′-GTAGGTTCCATTGCTTGTTC-3′

预期产3ADON毒素类型扩增片段大小为334bp；产15ADON毒素类型扩增片段大小为279bp；产NIV毒素类型扩增片段大小为497bp。

4.12无水乙醇。

4.13DNALadder：可以清楚区分100bp～1000bp的DNA片段。

4.14dNTPs混合溶液：将浓度为10mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合。

4.15TaqDNA聚合酶、PCR扩增缓冲液及25mmol/L氯化镁溶液。

4.1650×TAE缓冲液：称取484gTris，量取114mL冰乙酸，200mL0.5mol/LEDTA，溶于水中，定容至2L。分装后高压灭菌备用。使用时用水稀释成1×TAE电泳缓冲液（工作液）。

4.17加样缓冲液。

4.18琼脂糖。

4.19溴化乙锭。

5主要仪器和设备

5.1天平：感量0.1g和0.1mg。

5.2PCR扩