细胞转染技术.ppt

关于细胞转染技术第1页，共36页，星期日，2025年，2月5日目录基本原理1质粒提取扩增234常见问题及解决方案5影响转染实验的因素转染方法第2页，共36页，星期日，2025年，2月5日基本原理1将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。细胞转染——研究内容：研究和控制真核细胞基因功能应????用：基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验第3页，共36页，星期日，2025年，2月5日常规转染技术瞬时转染外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。稳定转染外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。第4页，共36页，星期日，2025年，2月5日第5页，共36页，星期日，2025年，2月5日脂质体介导转染脂质体转染的原理基于电荷吸引原理，先形成脂质体-DNA复合物，散布在细胞周围，然后通过细胞的内吞作用，将目的基因导入细胞内。第6页，共36页，星期日，2025年，2月5日1.?promega公司?Promega转染试剂产品适合于人HeLa，HepG2，293，K562，Jurkat；猴COS-7，CV-1；小鼠NIH3T3；仓鼠BHK，CHO；大鼠PC12；昆虫S19等等细胞系的RNAi转染。?2.?Invitrogen公司?Lipofetamine2000，适合于Hela，BHK，HEK，COS-7，PC12，NIH3T3等各种常用细胞系的RNAi转染。?3.?转染FAQs：转染试剂的选择脂质体复合物与贴壁细胞的接触机会比悬浮细胞高出很多倍，所以，脂质体转染时悬浮细胞的转染效率要明显低于贴壁细胞。悬浮细胞是用的电穿孔法。第7页，共36页，星期日，2025年，2月5日质粒提取扩增2质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。将细菌质粒转化到大肠杆菌中，然后从大肠杆菌中收获大量质粒的过程。——将质粒?DNA?导入细菌的过程1、质粒的转化感受态细菌细胞在?CaCl?2?低渗溶液中膨胀为球状（感受态细菌的制备，略）。质粒?DNA?与?CaCl?2?形成抗?DNase?羟基?-?磷酸钙复合物黏附于细菌表面，经?42℃?短时间热冲击处理，促进细胞吸收?DNA?复合物。在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。被转化的细菌中，外源基因得到表达。BL21(DE3)一般用于外源基因的原核表达，DH5a，TG1和HB2151一般用于重组质粒的克隆和扩增TG1长得慢，菌落较小，转化效率高，用于普通的克隆测序，BL21(DE3)长的快，菌落较大，转化效率低点，主要用于原核表达。第8页，共36页，星期日，2025年，2月5日感受态细菌细胞特点用途TG1长得慢，菌落较小，转化效率高，用于普通的克隆测序DH5aE.coliDH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。常用于分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。BL21(DE3)该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。长的快，菌落较大，转化效率低点。一般用于外源基因的原核表达JM109该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。第9页，共36页，星期日，2025年，2月5日细菌铺板：加入抗生素（终浓度是50ug/ml-100ug/ml）挑选菌落：从LB培养基上挑选菌落备用细菌培养：37摄氏度培养箱中以180rpm摇动12~14h，使大肠杆菌繁殖碱裂解抽提：采用细胞裂解的方式，从含目标质粒的大肠杆菌菌