蛋白质互作完整版本.pptVIP

Lecture4.1(c)2004July2004MichelDumontier(c)2004CGDN

蛋白质相互作用蛋白与配体的相互作用蛋白质相互作用

ProteinInteractionsProteinInteractions,Protein-proteininteractions蛋白分子的联系蛋白质之间的相互作用是在很多生物过程的基础性作用，许多重要的生物的功能：信号转导蛋白复合物蛋白修改内容分子间的相互作用发现实验计算数据存储数据挖掘今后的方向分子间的相互作用两个分子间的相互作用物：核酸，基因，蛋白质，复杂的分子，小分子，光子结合位点实验条件特定的细胞定位可能导致某些化学行动InteractionDiscoveryMethods免疫共沉淀Co-immunoprecipitation.双分子荧光互补BimolecularFluorescenceComplementation荧光共振能量转移Fluorescenceresonanceenergytransfer下拉化验Pull-downassays标签转移Labeltransfer酵母双杂交Theyeasttwo-hybrid.在体交联蛋白复合物Iin-vivocrosslinkingofproteincomplexes串联亲和纯化Tandemaffinitypurification(TAP)化学交联Chemicalcrosslinking双偏振干涉DualPolarisationInterferometry(DPI)蛋白质对接Protein-proteindocking(SLS)化学交联-电离质谱ChemicalcrosslinkingfollowedbyhighmassMALDImassspectrometry链球菌蛋白相互作用实验SPINE(Strep-proteininteractionexperiment)表面等离子体共振Surfaceplasmonresonance调查蛋白质的相互作用方法每个方法都有自己的长处和短处方法敏感性和特异性高灵敏度意味着发现许多的相互作高特异性意味着发现特定的相互作了解系统误差了解污染的蛋白质每种方法有不同的实验条件免疫共沉淀

Co-immunoprecipitation免疫共沉淀是以抗体和抗原间专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法-金标准是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。免疫共沉淀原理：IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“proreinA特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象开发出来的方法。目前多用精制的proreinA预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的proreinA就能吸附抗原。实验需要注意点抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白，缓冲液必须要使其溶解。防止蛋白的分解，修饰每次实验之前先考虑抗体/缓冲液的比例。免疫共沉淀优缺点优点:相互作用蛋白质是经翻译后修饰的，处于天然状态；蛋白相互作用在自然状态下进行,可避免人为影响；可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用两种蛋白质的结合可能不是直接结合，可能有第三者在中间起桥梁作用；必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。酵母双杂交

Yeasttwo-hybrid酵母双杂交筛选酵母细胞核内人工融合蛋白之间的相互作用。这种方法可以查明确定一种与特定蛋白质作用的配体。然而，该方法有一个臭名昭著的高假阳性率，必要使用免疫共沉淀核实确认。酵母双杂交基本原理特点与优点酵母双杂交系统快速、直接。酵母双杂交系统检测蛋白相互作用优点:作用信号是在融合基因表达后，在细胞内转录因子的作用而给出的，省了纯化蛋白质的繁琐步骤。检测在活细胞内进行,可一定程度上代表细胞内的真实情况。检测的结果是基因表达产物的积累效应,因而可检测蛋白质间的微弱的或暂时的相互作用。酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。高通量蛋白质复合物