公开课_天坛神经免疫中心-流式样本制备及分析分选技术.pdf

流式细胞术样本制备

流式细胞术的分析及分选

基本概念

流式细胞术（FlowCytometry,简称FCM）是一种能够

同时检测快速直线流动状态中的单个细胞的多项物理及

生物学特性，加以分析定量的技术，同时可以对特定群

体加以分选。

流式细胞仪（FlowCytometry,简称FCM）是集激光技

术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、

细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型

高科技仪器。

第一部分：流式样本制备

流式可检测的样本种类多样：

各种细胞（如外周血，骨髓，脾细胞，灌洗液，实体组织，

悬浮或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球等

血清、血浆、培养上清、细胞裂解液

流式样本制备：

单细胞悬液（天然，机械研磨/消化）

57

5×10－1×10cells/ml，约0.5ml，200目筛网过滤

样本制备：试剂

Stainingbuffer（PBE）：含2mMEDTA的PBS，

4℃保存。

抗凝剂：2%EDTA-PBS

红细胞裂解液（ACK）配方：

样本制备：骨髓细胞

小鼠骨髓细胞样品准备

1）脱颈处死小鼠，用75%酒精浸泡。

2）取小鼠后肢骨（股骨，胫骨），去除肌肉组织，用含2%血清的PBE冲出BM细

胞。将收集的BM细胞用尼龙膜过滤，计数，4℃，1600rpm，离心10min。

8

3）每10细胞加入80μlPBE。

8

4）每10细胞加入适量体积的标记抗体，冰上孵育15-60分钟。

8

5）每10细胞用5mlPBE洗一遍，4℃，1600rpm离心10min，弃上清。

6）用含2%血清的PBE重悬细胞，过滤膜（细胞悬液种可能有细胞聚集，最好是

上机之前过滤），上机分析或分选。

7）备注：无菌分选时使用含2%FBS+2%双抗的PBE重悬细胞。

样本制备：外周血细胞

小鼠外周血样品采集和流式检测样本制备

样品采集：

1）在1.5mlEP管中加入40μl抗凝剂（2%EDTA-PBS溶液）。

2）将小鼠放置于暖气片上数分钟，使其充血，用毛细血管取尾血10-20μl。

流式样本制备：

3）每管加入适量体积的标记抗体，冰上孵育15-30分钟。

4）每管1:9加入ACK红细胞裂解液，室温孵育10分钟。

5）每管加入1mlPBE，4℃，1600rpm离心10min，弃上清。

6）用300μl含2%血清的PBE重悬细胞，过滤膜（细胞悬液种可能有细胞聚集，最好是上机之前

过滤），上机检测。

样本制备：脾细胞

小鼠脾细胞流式检测样本制备

1）脱颈处死小鼠，用75%酒精浸泡。

2）取小鼠脾脏，置于含PBS的6孔板中，用20ml注射器针芯于200目滤网上研磨脾

脏，将收集的脾细胞用尼龙膜过滤。

6

3）每个样品管中加入1×10/50μl细胞，加入适量抗体进行标记。

4）加入1mlPBE，1600rpm离心10min，弃上清。

5）脾细胞中加入500μl红细胞裂解液，立即于4℃，1600rpm离心10min（骨髓细

胞无需此步）。

6）弃上清，加入300-500μl含2%血清的PBE重悬，过膜，上机检测。

样本制备：脑细胞

小鼠脑细胞流式检测样本制备

1）使用致死剂量的麻醉剂麻醉小鼠。

2）使用冰PBS进行心脏灌流，分离脑组织。

3）取小鼠脑组织，置于含PBS的6孔板中，用20ml注射器针芯于200目滤网上研磨。

4）加入1mlPBE，1600rpm离心10min，弃上清。

5）用5ml30%的Percoll重悬细胞，400g离心30分钟，弃去上层的髓鞘碎片和液体，保留细胞

沉淀。

6）使用PBS洗细胞沉淀2次，显微镜下计数。

6

7）每个样品管中加入1×10/50μl细胞，加入适量抗体进行标记。

8）加入1mlPBE，1600rpm离心10min，弃上清。加入300-500μl含2%血清的PBE重悬，过膜，

上机检测。

第二部分：流式分析和分选

流式细胞仪构造（五部分）：

流动室及液流驱动系统

激光光源及光束成形系统

光学系统