农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验步骤.pdf

农杆菌侵染烟草叶片表

皮细胞实验步骤

标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]

农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验步骤

整理人：早熟组赵凤利

一、准备试剂：

1.加有三抗的YEB或LB液体培养基，用于摇菌；

2.渗透液(50ml)：250mgD-glucose，5mlMES原液，5mlNaPO·12HO原

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液，5ul1M乙酰丁香酮原液，加dHO至50ml。

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1).500mMMES(Sigma)：4.88g溶于50mldHO，保存于4℃

2

2).20mMNaPO·12HO(BDH)：0.38g溶于50mldHO，保存于4℃

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3).1M乙酰丁香酮：0.196g，加DMSO至1ml，可分装成小剂量，存于-

20℃。

二、实验步骤：

1.将检测成功的农杆菌菌液过夜扩摇，28℃,200rpm；

2.取1-1.5ml菌液，加到灭菌的1.5ml离心管中；

3.1000g，10min，沉淀菌体(室温)，去上清，加1ml渗透液，悬浮菌体；

4.重复步骤3，进一步除去少量的抗生素；

5.取少量悬浮菌液稀释10倍，测定OD值，并乘以10，作为悬浮菌液的OD

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值；

注：如果悬浮菌液的OD值在1.5-2.0之间，说明有大量的死菌细胞，将降低转化的效率。

600

6.确定悬浮菌液对渗透液的滴定度，计算稀释系数，使最终悬浮菌液(用于侵

染)为0.5-5.0ml，OD为0.01-0.1，通常0.5-1.0ml的最终悬浮菌液就能满

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足侵染了；

如：需要OD=0.1的500ul最终悬浮菌液，而测定的悬浮菌液的OD=0.4，则最终悬浮菌液中，悬浮菌

600600

液的用量为(0.1*500)/0.4=125ul，则需要渗透液为375ul。

7.在1.5ml离心管中，配好最终悬浮菌液，准备侵染；

8.侵染前，将烟草放于白色荧光灯下1h，使其气孔打开；

9.选择倒三叶和倒四叶，用于侵染(于两叶脉之间侵染)，一株选两叶，侵染一

种菌液；

2

10.用去掉针头的注射器，轻柔地摩擦待转叶片的背部(0.5cm)，或用小针头

刺穿，以去除其蜡质层；

11.侵染前，用记号笔标记待转区域；

12.将第7步中的最终悬浮菌液吸入1ml去针头的注射器中

13.将注射器对着叶片背面的待转区域，一手按着叶片上面，另一手轻轻推动

活塞，直到看到液体扩散，再侵染其他部位，侵染后，用记号笔圈定侵染区

域；

14.将侵染后的烟草放回培养室

15.2-3天后：

1).亚细胞定位实验：切掉侵染区域，制片，荧光显微镜观察；

2).启动子GUS活性：GUS染色，75%酒精脱色，观察结果。

参考文献：NatureProtocols,2006:2019-2025.