DB37T 2843-2016 鸭坦布苏病毒双抗体夹心ELISA检测方法.docxVIP

ICS11.220B41

DB37

山东省地方标准

DB37/T2843—2016

鸭坦布苏病毒双抗体夹心ELISA检测方法

DetectionmethodonDuckTembusuVirusbyadoubleantibodysandwichELISA

2016-09-18发布2016-10-18实施山东省质量技术监督局发布

I

DB37/T2843—2016

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。

本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东农业大学。

本标准主要起草人：刁有祥、陈浩、唐熠、提金凤、冯强、欧全宾。

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DB37/T2843—2016

鸭坦布苏病毒双抗体夹心ELISA检测方法

1范围

本标准规定了鸭坦布苏病毒双抗体夹心ELISA方法的样品采集和保存、样品处理、试剂及仪器、检测步骤、结果判定等。

本标准所规定的鸭坦布苏病毒双抗体夹心ELISA方法适用于检测鸭组织、分泌物、排泄物和鸭胚尿囊液中的坦布苏病毒，也适用于鹅和其他动物坦布苏病毒的检测。

2试剂及仪器

2.1试剂

2.1.1捕获单抗，抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体。

2.1.2检测单抗，辣根过氧化物酶标记(HRP)的另一株抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体，简称酶标单抗。

2.1.3阳性对照：坦布苏病毒鸭胚尿囊液。

2.1.4阴性对照：SPF鸭胚尿囊液。

2.1.5磷酸盐缓冲液(PBS),见A.1。

2.1.6包被液，见A.2。

2.1.7洗涤液，见A.3。

2.1.8样品稀释液、封闭液，见A.4。

2.1.9底物溶液，商品化TMB底物显色液。

2.1.10终止液，见A.5。

2.1.11甘油盐水，见A.6。

2.2仪器

2.2.1酶标仪。

2.2.2微量加样器。

2.2.3恒温培养箱。

2.2.4聚苯乙烯板。

2.2.5水平振荡器。

2.2.6生物安全柜。

3样品准备

3.1样品的采集和处理

3.1.1样品的采集

死亡鸭采集卵泡膜、脾和脑等组织样品，进行分别处理或同时处理；活鸭采集咽喉或泄殖腔拭子。

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3.1.2样品的保存

样品应放在含有抗生素的pH值7.0~7.4的等渗磷酸盐缓冲液内(无PBS可用25%～50%甘油盐水)。抗生素的选择视当地情况而定，组织和咽喉拭子悬液中应含有青霉素(2000IU/mL)、链霉素(2mg/mL)、庆大霉素(50μg/mL)和制霉菌素(1000IU/mL),加入抗生素后pH值应调至7.0~7.4。在室温放置1h~2h内样品应尽快处理。不能尽快处理的可在4℃存放24h,也可于低温条件下保存(-70℃贮存最好)。

3.1.3样品的处理

样品的处理在生物安全柜中进行。喉头或泄殖腔拭子，置于200μL含有抗生素的pH值7.0~7.4等渗磷酸盐缓冲液中；对组织样品取0.2g置于500μL含有抗生素的pH值7.0~7.4等渗磷酸盐缓冲液中研磨，反复冻融3次；8000r/min离心5min,取上清作为检测材料。

4操作步骤

4.1试验试剂预温到20℃~25℃。

4.2将捕获单抗用包被液稀释成2.5ng/μL,每孔100μL加入96孔聚苯乙烯板中，4℃孵育过夜。

4.3用洗涤液100μL洗3次，每次置于水平振荡器300r/min震荡3min,甩干板上残余液体。

4.4每孔加入200μL封闭液，恒温培养箱37℃孵育1h,用4.3方法洗板。

4.5在A1、A2孔各加100μL阴性对照，A3、A4孔各加100μL阳性对照。

4.6将待检样品加入其他各孔，每孔100μL,恒温培养箱37℃孵育1h,用4.3方法洗板。

4.7将酶标单抗用样品稀释液按1:1000倍稀释，每孔加100μL,37℃孵育1h,用4.2方法洗板。

4.8每孔加100μL底物溶液，37℃避光孵育15min。

4.9每孔加入50μL终止液，轻轻振荡，终止反应。

4.10置酶标仪于450nm测定各孔吸光度(OD)值，该操作需30min内完成。

5结果判定

5.1