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探究霉菌的筛选及其产生纤维素酶的最适Ph值

及温度条件

一．实验目的

纤维素酶(EC3.2.1)是一类可广泛应用于医药、食品、棉纺、

环保及可再生资源利用等领域的酶制剂。探究霉菌高效生产纤维素酶

的适宜条件可以为工业生产创造有利条件。有利于开发微生物产物的

市场经济。

二．实验原理

能够分解纤维素的微生物很多。既有好氧性微生物，也有厌氧

性微生物；既有细菌，也有放线菌和真菌。许多真菌具有很强的纤维

素分解能力。其中主要有木霉、镰刀霉、青霉、曲霉、毛霉、葡萄孢

霉等属的一些种。在森林的枯枝落叶中，占优势的纤维素分解菌是担

子菌。在潮湿土壤中，真菌也是纤维素分解的优势菌群。

普通纤维素酶的最适作用温度多为45～65℃，Ph值为8.0。

而产生纤维素酶的霉菌的生长最适温度为28~40℃，Ph值为7.0以下

三．实验用到的基本技术

微生物筛选、分离、提纯技术，无菌培养技术、摇瓶培养技术，

刚果红染色法等（见参考资料）

四．1．实验仪器

250mL锥形瓶、无菌称量瓶、药匙、1mL和10mL的移液管、

天平、摇床、温度计、无菌培养皿、涂布器、1mL移液管，装有9mL

无菌水的20mL大试管，温箱等。

2．实验药品和试剂

蒸馏水，酸碱试剂，土样

五．实验步骤

1.土样采集

土样的采集要选择富含纤维素的环境（落叶堆积，阴暗潮湿的

环境），这是因为在纤维素含量丰富的环境，通常会聚集较多的

分解纤维素的微生物。采集土壤下5~25cm出的土样（最好有可见

菌丝）如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，过一个

月左右也会有能分解纤维素的微生物生长。

2.选择培养

培养基的制备参照课本旁栏中的比例配制。在250mL锥形瓶

中装入30mL培养基，用8层纱布做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在

瓶塞外包裹两层包装纸（或报纸），用线绳扎紧，在121℃下高

压蒸汽灭菌20min。

选择培养的操作：称取土样20g，在无菌条件下加入装有30mL

培养基的摇瓶中。将摇瓶置于摇床上，在30℃下振荡培养1～2d，

至培养基变混浊。此时可以吸取0.1mL培养液进行梯度稀释和涂

布平板，也可以按课本中所述，重复选择培养的步骤一次，然后

再进行梯度稀释和涂布平板。

3.刚果红染色法分离

培养基的制备参照课本旁栏中的比例配制。在500mL三角

瓶中装入200mL培养基，在121℃下高压蒸汽灭菌20min。

倒平板操作：将灭菌后的固体培养基熔化，按无菌操作的

要求，在无菌的培养皿中倒入15～20mL培养基，凝固后待用。

制备菌悬液：按照本专题课题1的稀释操作方法，将选择

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培养后的培养基进行等比稀释，稀释最大倍数至10。

涂布平板：将稀释度为104～106的菌悬液各取0.1mL，

滴加在平板培养基上，用涂布器将菌液涂布均匀，在30℃倒

置培养，至菌落长出。每个稀释度下需涂布3个平板，并注意

设置对照。

4.菌株形态学观察

取25℃培养4～6d的菌株Z6进行革兰氏染色、荚

膜染色，于光学显微镜下观察形态。

5.探究真菌产生纤维素酶的最适温度

将菌株种子液分别以2%的接种量接入培养基中，分别在10、

15、20、25、30和35、40、45、50、55、60、65℃下摇

床培养32h.

分别将培养后的菌株接种到等面积的棉织品布块上，每隔一小

时记录布块的变化情况。

6.探究真菌产生纤维素酶的最适Ph值

将菌株种子液分别以2%的接种量接入培养基中，分别在Ph

值为9.0、8.0、7.06.0、5.0、4.0、3.0时摇床培养32小时