多重连接探针扩增(MLPA)的原理及其应用.pptxVIP

多重连接探针扩增技术

及其应用深圳市天大生物医疗器械有限公司苏海静副总经理

MLPA技术简介主要内容MLPA技术特点与主要应用领域MLPA技术工作流程数据分析(Coffalyser的使用)

MLPA技术简介

MLPA:多重连接探针扩增技术主要应用领域：多重检测人类基因组序列中微小的拷贝数变异该技术于2002年首次发表：SchoutenJPetal:NucleicAcidsRes.30:e57。发表的MLPA技术相关的文章超过一千篇。每年运行的MLPA测试超过一百万次。使用MLPA技术的实验室超过一千个并分布于在80个不同的国家。荷兰MRC公司提供MLPA试剂盒包括了300多种的应用领域：--人类基因组学--分子细胞遗传学--肿瘤诊断学

间隔序列(对于不同探针长短不同)多重连接探针扩增技术原理Schouten,J.P.etal.Nucl.AcidRes.30,e57.1.变性2杂交PCR上游引物杂交序列PCR下游引物上下游杂交探针彼此相邻，由热稳定的连接酶连接。3.连接目标序列BX5’5’3’YX5’5’3’目标序列AY5’3’目标序列A目标序列B5’3’4.PCR每种探针的扩增产物都有自己特异的标志性长度（130-480bp）。5’3’5’3’XY5’3’XY5’3’所有连接产物均由同一对引物进行PCR扩增。5.毛细管电泳分析扩增产物通过与对照DNA标本比较相同片段长度峰高的不同来确定目标序列的对拷贝数变化。5’5’5’

“Stuffer”sequence右侧杂交探针的制备EcoRVSphIXbaIBsmIPCRprimersequence(vector:blueplaques)EcoRVSphIXbaIBsmI“Stuffer”sequencePCRprimersequence(clone:whiteplaques)EcoRVBsmI人工合成的杂交序列被克隆到来源于M13的SALSA载体上。每个SALSA载体都包括了一段不同长度的间隔序列。通过克隆获得单链DNA。将两个短的寡核苷酸序列与单链DNA退火，从而获得带BsmIandEcoRV位点的双链DNA。Hybridisingsequence经EcoRVandBsmI酶切后,可以获得85-440nt长的探针序列.“Stuffer”sequenceHybridisingsequencePCRprimersequence

MLPA工作原理特点1、检测对象为和两条MLPA探针完全配对的样品DNA序列；2、扩增对象是杂交在样品上的两条探针由连接酶进行连接之后的产物；3、不同基因的连接产物长度不同；4、多重的连接产物能够被同一对引物扩增；PCR具有高度的同步性；5、扩增产物（大小一般为130-500nt)用于毛细管电泳分析；6、基因拷贝数变化直接体现在毛细管电泳结果的峰面积差异；7、基因点突变体现在扩增峰缺失；8、

所需仪器只需普通PCR仪和一台测序用的毛细管电泳仪。耗时在24小时以内。

MLPA工作流程

MLPA的操作流程变性样品DNA在98度下加热5分钟。杂交往变性后的样品中加入SALSA探针混合液和MLPA缓冲液。混合体系在95度下加热1分钟后在60度下温浴杂交16个小时。连接在杂交产物中加入连接酶混合液在54度下温浴连接15分钟。98度加热5分钟使连接酶失活。PCR加入引物，dNTP和DNA聚合酶。PCR反应。毛细管电泳将扩增片段长度和结果峰导入到excel表中。分析结果。

MLPA质控片段可以识别DNA样品浓度是否合适P002;5ng.DNA10ng.DNA20ng.DNA50ng.DNAX=引物二聚体X=引物二聚体

每个MLPA探针混合液都包括质控片段当DNA样品量不足时，4个质控片段（64-70-76-82nt）的峰会产生很高的信号当DNA样品变性不完全时，两个探针(88-96nt)会给出警示信号.X染色体(100nt)和Y染色体(105nt)片段可以指示样本是否置换.XY2xDNADenaturationcontrolfragments

TE,98oC.TE,94oC.

TE,98oC.TE,82oC.

TE,98oC.TE,76oC，并不是所有的染色体区域都变性

DNA样本的要求MLPA反应要求基因组DNA的使用量范围为20-500ng。为了减少差异，尽量使用与待测样本