蛋白质分析鉴定.pptVIP

第六章

蛋白质的分析和鉴定技术;第一节

蛋白质的物理化学性质分析;蛋白质由氨基酸构成，具有氨基酸的一些功能基团，保存了一些氨基酸的性质，但又发生了质的变化，具备一些氨基酸没有的性质。

;、蛋白质的两性解离和等电点

两性解离：蛋白质是两性电解质，解离情况比氨基酸复杂得多。

在特定的pH值范围内，蛋白质解离产生带正电荷或负电荷的基团，分折蛋白质的滴定曲线可得到各解离基团的PK′值

;等电点pI

指某一pH值时，蛋白质所带正负电荷恰好相等，净电荷为0，此时溶液的pH值称为等电点。

蛋白质分子所带电荷的性质和数量由蛋白质分子中可解离基团的种类和数目、溶液pH值所决定。

pH大于pI，蛋白质带负荷，电场中向阳极移动

pH=pI，电场中不移动，蛋白质沉淀出，此时导电率、渗透压、粘度等均达最低值。

pH小于pI，蛋白质分子带正电荷，电场向阴极移动。

;蛋白质的等离子点〔特征常数〕：

指在纯水中〔即没有其它盐类存在〕蛋白质的正离子数等于负离子数的pH值。因蛋白质的等电点不是一成不变的，它随溶剂性质、离子强变等因素而改变。;二、蛋白质分子的大小

相对分子质量Mr从一万到几百万或更大，对Mr的测定，按性质分两类：

1.根据化学组成测定最低相对分子量

利用化学分析定量测定蛋白质中某一特殊元素的含量，并假定蛋白质分子中含1个这种元素，;2.用物理化学方法来测定蛋白质的相对分子质量

是目前常用的方法，包括测定质点的：扩散系数、沉降超离心、凝胶过滤、渗透压等。

渗透压测定法最为方便，但准确度较差，超离心法最为准确，但需昂贵的超速离心机，

;三、蛋白体的胶体性质

胶体：指质点大小在1nm-100nm范围内所构成的分散系统

蛋白分子直径2nm-20nm，其溶液是胶溶液并且其分子外表分布有亲水氨基酸的极性R基，是一种亲水胶体，具有亲水胶体的性质：

1、具有半通透性2、丁达尔效应3、布朗运动等

。;蛋白质相对分子质量大，在溶液中形成的颗粒大，不能通过半透膜。

透析：??用蛋白质不能通过半透膜的性质将其与小分子物质分开的别离方法;四、蛋白质的沉淀作用

蛋白质保持稳定的亲水胶体状态，这种稳定性主要由两因素决定：

1、水化作用

存在有极性R基〔—NH2、—COOH、—OH等〕，故蛋白质分子外表结合有一层水分子，称为水化膜，其可防止分子互碰而聚集。;2、电荷排斥作用

蛋白质是两性分子，一定pH值下，分子带相同电荷，同性电荷互斥，使分子不能聚集。

由此，改变稳定性的条件，蛋白质的稳定性被破坏，从溶液中沉淀出来：

a参加脱水剂除去水膜

b使pH=pI

c参加电解质使质点外表失去同种电荷。;五、蛋白质的变性作用

天然蛋白质受到理化因素的影响，氢键、盐键等次级键维系的高级结构遭到破坏，分子内部结构发生改变，致使生物学性质、理化性质改变的现象。

;物理因素：

加热、紫外线、X—射线、超声波

化学因素：

强酸、强碱、尿素、乙醇、三氯醋酸等

蛋白质变性后，结构虽有改变，但组成成分和Mr没有改变

;六、蛋白质的颜色反响

可作为蛋白质定性定量测定的依据

;1、茚三酮反响(NinhydrinReaction)

α－氨基酸和水化茚三酮(苯丙环三酮戊烃)功能时，产生蓝色反响，由于蛋白质是由许多α－氨基酸组成的，所以也呈此颜色反响。

;2、双缩脲反响(BiuretReaction)

蛋白质在碱性溶液中和硫酸铜功能呈现紫红色，称双缩脲反响。凡分子中含有两个以上－CO－NH－键的化合物都呈此反响，蛋白质分子中氨基酸是以肽键相连，因此，所有蛋白质都能和双缩脲试剂发生反响。;3、米伦反响(MillonReaction)

蛋白质溶液中参加米伦试剂(亚硝酸汞、硝酸汞及硝酸的混和液)，蛋白质首先沉淀，加热那么变为红色沉淀，此为酪氨酸的酚核所特有的反响，因此含有酪氨酸的蛋白质均呈米伦反响。;第二节蛋白质分析技术;氨基酸序列分析

电泳技术

空间结构分析

生物质谱技术

;多肽链中氨基酸序列分析;确定蛋白质分子的一级结构，一般需要经过以下步骤：

纯化待测的蛋白质分子，测定其分子量并确定分子中多肽链的数目。

对于由两条及两条以上多肽链组成的蛋白质分子，那么