蛋白质分离技术-层析.pptVIP

蛋白质别离技术-层析;一、概述;分子极性

分子大小

分子形状

离子亲和力分子亲和力吸附能力;1903年俄国植物学家茨维特

发表了有关填充以菊根粉的玻璃柱别离植物色素，以石油醚冲洗，得到黄色、绿色区带;

1970s早期

高效液相色谱法〔HPLC)

目前

气相层析仪和HPLC与色谱、质谱以及计算机联用。;层析法进行时有两个相，一个相称为固定相，另一相称为流动相。;气

相

层

析;2.按层析的机制可分为;定义

指混合物随流动相通过吸附剂时，由于吸附剂对不同物质的吸附力而使混合物别离的方法。;吸附层析;〔2〕分配层析;柱层析

进样量大且容易回收

薄层层析

小量样品，快速，

操作简便;■层析法的演变过程：;纸层析;三.层析的一般原理;纯化生物物质的纯度

取决于混合物中各组分K值的差异程度。

混合物中各组分假设K值相差较大,那么能较易地把混合物中的生物物质别离。反之,K值相差较小,不易把混合物中的生物物质别离。;凝胶层析

GelChromatography;一、根本原理;固定相〔凝胶〕;■凝胶层析法：;;凝胶层析过程的数理关系;柱床体积VT;Ve-Vo

Kd=————

Vi;(2)Ve=Vo+Vi

Kd=1

分子完全不被排阻

完全向凝胶颗粒内部扩散

在两相分配的比值为1,最后流出.;?三.凝胶层析的优点

1.凝胶是一种不带电荷的惰性载体，结构稳定。

2.操作条件较温和。

3.样品得率高,重复性好,可进行大量样品的别离纯化。;五、凝胶的结构

与性能;〔2〕特点：;;大孔凝胶

工作范围的下限几乎是Sephadex的上限

可别离MW40万以上的物质

可用来别离核酸及病毒。;■

各

种

层

析

胶

体

：;六.其它条件选择;Elutionvolume(ml);测分子量;实验：

凝胶层析法别离蛋白质;血红蛋白64,480

二硝基苯-鱼精蛋白2,000-12,000

SephadexG-50孔径1,500-30,000;1、装柱

※先用蒸馏水赶走层析柱中的死体积；

※凝胶不能有气泡和分层现象；

※装柱结束后要保持凝胶外表平整。;2、加样

※使液面和凝胶外表相切，关闭出口；

※加样时尽量不要破坏凝胶面；

※让样品进入凝胶以??在加蒸馏水开始洗脱。;血红蛋白和二硝基苯-鱼精蛋白的洗脱体积？

柱的外水体积和内水体积;亲和层析

AffinityChromatography

?

;一、原理;根本过程;+;解吸;样品

;;;酶：基质类似物，抑制剂，辅酶

抗体：抗原，病毒，细胞

细胞：细胞外表特异蛋白，外源凝集素

核酸：互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶，

结合蛋白

激素或药物：受体，载体蛋白

外源凝集素：多糖，糖蛋白，细胞外表受体，细胞;〔一〕载体的选择;2、常用载体

〔1〕纤维素

特点：价廉、来源充足

纤维性、非均一性限制大分子的掺入

非专一性吸附严重

用于抗体和酶的纯化;?〔3〕琼脂糖凝胶;〔4〕聚丙烯酰胺凝胶;〔二〕配基的选择;以酶和底物为例：;〔三〕固相化——将配体以共价键连接于固相基质上制成固相化吸附剂;二、亲和层析别离;洗脱方法

〔1〕非特异性洗脱：改变

洗脱液pH值

离子强度

梯度洗脱

〔2〕特殊洗脱：当蛋白吸附紧密或上述方法洗脱会引起失活，可用专一的化学方法裂解配基与载体的连接键，再用透析或凝胶层析法去除配基。

断键方法：硫酯键、偶氮键、二硫键

〔3〕专一性洗脱;已使用过和柱，经过再生处理，去除非特异吸附的杂质后，可重复使用。

再生步骤：

起始缓冲液重复平衡一次

用高离子强度和低离子强度溶液处

用弱酸或弱碱溶液处理;三、特点

;四、应用;实验

别离豌豆凝集素;;离子交换层析

ionexchangechromatography;一、原理;低盐;带电荷;离子交换树脂如何别离蛋白质;二、离子交换剂的类型;1.离子交换树脂：

(1)类型

聚苯乙烯树脂：;聚丙烯酸—阳离子交换树脂

甲基丙烯酸二乙烯苯

特点：高交换量

pH8羧基不完全解离;〔2〕离子交换树脂的