碱性蛋白酶的发酵、自切和水解肽谱解析.pdfVIP

摘要

芽孢菌来源的碱性蛋白酶，是重要的工业酶制剂，广泛应用于食品蛋白的加工，

改善蛋白食品的品质，增强食品的营养，制备具有多种功能的生物活性肽等。目前

碱性蛋白酶的发酵和应用尚存在诸多问题，如发酵产酶水平不高，自切失活机制不

清楚，水解食品蛋白的位点选择倾向性和肽谱规律不明确等，制约了碱性蛋白酶产

业化的发展和应用水平的提高。为此，本研究首先在碱性蛋白酶已有解淀粉芽孢杆

菌发酵工艺基础上，解析了发酵过程中氨基酸的动态变化，探索通过补充氨基酸提

高发酵产酶水平；其次解析了碱性蛋白酶的自切规律，明确了倾向的自切位点；最

后解析了碱性蛋白酶水解多种食品蛋白的肽谱变化规律，为多肽水解提供理性指导。

理论上，氨基酸供给不平衡可能制约了菌体的生长和酶的合成。本实验采用高

效液相色谱法分析了发酵过程中氨基酸浓度的动态变化，结果显示丝氨酸，精氨酸，

天冬氨酸，谷氨酸，脯氨酸，苏氨酸六种氨基酸在发酵过程中下降，推测这六种氨

基酸的快速下降可能限制了菌体的生长或酶的合成。探索通过补充氨基酸提高发酵

产酶水平，结果显示补充添加0.5%丝氨酸时产酶水平增长最大，相比对照增加

29.87%；添加0.2%精氨酸时产酶水平也有所增长，相比对照提高21.07%。另外，

考察了豆粕酶解预处理对发酵产酶的影响，比较了碱性蛋白酶和酸性蛋白酶的预处

3h

理效果，结果显示，豆粕碱溶后酸性蛋白酶酶解的预处理措施，显著提高发酵

产酶水平，相比对照提高了18.7%。

碱性蛋白酶的自切是导致其生产、储存和应用中酶活损失下降的主要因素之一，

解析其自切过程和规律，明确自切位点，对于促进酶的改造和应用具有重要意义。

本研究采用基于iTRAQ稳定同位素标记的定量蛋白质组学技术，通过高效液相色谱

-四极杆飞行时间串联质谱，解析了碱性蛋白酶自切过程不同时间点的肽段组成及其

R44N198A149N115

动态变化，鉴定了其容易发生自切的位点，包括位点、、和等，

这些位点的明确为将来通过分子改造提高碱性蛋白酶的稳定性提供了理性依据。

为研究碱性蛋白酶水解食品蛋白的肽谱变化规律，本研究分析比较了该酶对大

豆分离蛋白、牛血清蛋白、乳清蛋白、卵清蛋白和胶原蛋白等动植物食品的水解过

程，明确了这些底物蛋白的易切割位点。碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白，倾向于在

丙氨酸、苏氨酸、谷氨酸、丝氨酸的N端肽键与亮氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷

C

氨酰胺的端肽键水解；碱性蛋白酶水解牛血清蛋白，更倾向于在苏氨酸、组氨酸、

NC

丙氨酸、的端肽键与丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸的端肽键。对混合蛋白的水解肽

谱分析，表明该碱性蛋白酶更容易水解牛血清蛋白和大豆分离蛋白。

本研究对碱性蛋白酶发酵过程、自切位点和水解肽谱规律的解析，对于促进碱

性蛋白酶改造、生产和应用具有重要意义。

关键词：碱性蛋白酶；自切；肽谱

ABSTRACT

Alkalineproteasederivedfrombacillusisanimportantindustrialenzyme

preparation,whichiswidelyusedintheprocessingoffoodprotein,improvingthequality

ofproteinfood,enhancingthenutritionoffood,andpreparingbioactivepeptideswith

variousfunctions.Atpresent,therearestillmanyproblemsinthefermentationand

applicationofalkalineprotease,suchaslowleveloffermentationenzymeproduction,

unclearmechanismofself-deactivation,