DB22_T2010-2014_家畜（猪牛羊）戊型肝炎病毒的测定RT-PCR法_吉林省.docxVIP

ICS11.220

B41

DB22

吉林省地方标准

DB22/T2010—2014

家畜（猪牛羊）戊型肝炎病毒的测定

RT-PCR法

DetectionofHepatitisEvirusbyRT-PCRinLivestock（pig/cattle/sheep）

吉林省质量技术监督局

发布

DB22/T2010—2014

前

言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。

本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。

本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院。

本标准主要起草人：苏双、邵洪泽、许志林、程荣华、王楠、李琳、毛文智、王忠国、李文东，于

丹。

1

DB22/T2010—2014

家畜（猪牛羊）戊型肝炎病毒的测定RT-PCR法

警告─使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。

使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。

1范围

本标准规定了家畜（猪牛羊）戊型肝炎病毒RT-PCR测定方法。

本标准适用于猪、牛、羊等家畜戊型肝炎病毒的测定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

戊型肝炎病毒科成员。一种单股正链RNA病毒，呈球形、直径27～34nm，无囊膜，核衣壳呈二十

面体立体对称。病毒基因组长约7.2knt，有3个开放阅读框（ORF1、ORF2、ORF3）。ORF2位于3′端，

为主要的结构基因编码区，可编码核衣壳蛋白。

聚合酶链反应（PCR）技术是一种在体外快速扩增特定DNA片段的方法。由热变性→复性→延伸

三步反应组成一个PCR循环，经过多次循环反应，使目的DNA得以大量扩增。

4试剂与材料

2

DB22/T2010—2014

引物序列见表1，引物浓度为25mmol/L。

表1特异性引物序列

引物种类

外引物

引物名称

HEV-1

HEV-2

HEV-3

HEV-4

特异性引物的核苷酸序列

扩增片段长度（bp）

5-TAYCGHAAYCAAGGHTGGCG-3

5-TGYTGGTTRTCRTARTCCTG-3

5-ATWCATGGVTCRCCTGTGAA-3

5-AAATYAATTCTGTCGGRAGC-3

524

（第1次PCR引物）

内引物

328

（第2次PCR引物）

注：R=A/G，Y=C/T，W=A/T，H=A/C/T，V=A/C/G。

4.2

试剂

4.2.1

RNA提取试剂盒

4.2.2RT-PCR试剂盒

4.2.3DNA分子质量标准（DNAMarker）

DNA分子质量标准可采用100bpDNAladderMaker、DNAMarkerDL2000或其它等效产品。

4.2.4其它试剂

4.2.4.1

4.2.4.2

4.2.4.3

4.2.4.4

双蒸水：符合GB/T6682中4.2二级水要求；

0.1%DEPC水：见附录A中A.1；

4.3.1一次性无菌手套或乳胶手套；

4.3.21.5mL离心管；

4.3.30.2mLPCR反应管；

4.3.4琼脂糖；

5仪器设备

3

DB22/T2010—2014

5.3电泳槽；

5.4紫外光透射仪或凝胶成像系统；

5.5高速台式冷冻离心机：12000r/min；

5.6微型高速离心机：12000r/min；

5.7水浴锅：30-100℃；

5.8分析天平：感量0.1g；

5.9微波炉；

5.10-20℃冰箱；

5.11旋涡振荡器；

5.12乳钵或玻璃研磨器；

5.13微量移液器。

6样品的采集及处理

6.1肝脏样品的采集及处理

采取肝脏样品约1.0~2.0g，置于灭菌研钵中，充分研磨成匀浆，加入灭菌的1mol/LPBS溶液配

成1︰5乳悬液，反复冻融3次。4℃8000r/min离心5min，收集上清液，供RNA抽提或者-20℃保存备

用。

6.2粪便样品的采集及处理

挑取0.5~1.0g粪便样品于1.5mL离心管内，加入灭菌的1mol/LPBS溶液，旋涡震荡混匀，制备

成10%的粪便悬液，4℃8000r/min离心10min，收集上清液，供RNA抽提或者-20℃保存备用。

取上述处理好的样品100μL于1.5mL无RNA酶离心管中，每管加入1000μLTrizol试剂，混匀，

室温放置5m