DB22_T2012-2014_福氏阿米巴原虫检测方法_吉林省.docxVIP

ICS11.220

B41

DB22

吉林省地方标准

DB22/T2012—2014

福氏阿米巴原虫检测方法

DetectionofNaegleriafowleri

吉林省质量技术监督局

发布

DB22/T2012—2014

前

言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。

本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。

本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院。

本标准主要起草人：曹利利、姚新华、苑淑贤、程荣华。

I

DB22/T2012—2014

福氏阿米巴原虫检测方法

警告─使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。

使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。

1范围

本标准规定了水环境中福氏阿米巴原虫的分离鉴定和聚合酶链式反应（PCR）检测方法的技术要求。

本标准适用于生活用水、畜舍蓄水池中福氏阿米巴原虫的检测。

2

规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

耐格里属阿米巴属于双鞭毛阿米巴科原虫，多孳生于淡水中，有滋养体和包囊2个生活阶段，滋养

体呈长阿米巴型，大小为7×20μm，在不良环境中可形成有2根鞭毛的滋养体；包囊圆形，直径9μm，

单核。现知该属有5个种N．gruberi,N．foweri，N．lovaniensis，N．jadini和N.austratiensis，

其中能致病的以福氏耐格里阿米巴原虫（N．fowleri）为主。人或动物接触污染水体或在游泳池游泳，

福氏耐格里阿米巴滋养体可侵入鼻腔增殖后穿过鼻粘膜和筛状板，经嗅神经上行入脑部寄生，引起急性

原发性阿米巴脑膜脑炎，因此又被称作“食脑虫”。

体外培养invitroculture

将寄生虫活体结构或活虫从寄生体内或外部环境中分离出来，放在类似的生存环境（模拟体内温度，

湿度，营养条件），让虫体生长发育的方法并维持其结构和功能。

1

DB22/T2012—2014

聚合酶链反应（PCR）是一种级联反复循环的DNA合成反应过程。一般由三个步骤组成：模板的

热变性，寡核苷酸引物复性到单链靶序列上以及由热稳定DNA聚合酶催化的复性引物引导的新生DNA

链延伸聚合反应的过程。

4试剂与材料

4.1

引物

引物序列如下，引物浓度为15pmol/μL。

上游引物：5’-GTGAAAACCTTTTTTCCATTTACA-3’

下游引物：5’-AAATAAAAGATTGACCATTTGAAA-3’

4.2试剂

除另有规定，本标准所用试剂均为分析纯，水应符合GB/T6682中4.2二级水要求。

4.2.1阿米巴生理盐水(AmebicSaline,简称AS)（见附录A.1）

4.2.2阿米巴无营养琼脂平板(NonnutrientAgar,简称NNA)（见附录A.2）

4.2.3灭活大肠杆菌溶液（见附录A.3）

4.2.4阿米巴培养缓冲溶液（见附录A.4）

4.2.5真核细胞DNA提取试剂盒

4.2.6标准分子量DL2000Marker

4.2.7PCR反应试剂盒

4.2.101.0%琼脂糖凝胶（见附录A.7）

4.2.11电泳上样缓冲液（见附录A.8）

4.3材料

4.3.6吸头:10μL、200μL、1000μL；

4.3.7琼脂平板。

5仪器设备

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DB22/T2012—2014

5.7倒置显微镜；

5.8恒温水浴锅：30-100℃；

5.9恒温培养箱；

5.10分析天平：感量0.1g；

5.11接种环；

5.12接种涂布器；

5.134℃冰箱。

6样品

6.1采集

6.1.1采样地点

畜禽饮用水源、畜舍蓄水池等边缘。

6.1.2采样位置

水面至水面下40㎝。

6.1.3采样方法

用无菌试剂瓶直接取指定位置待检水样1000mL。

6.1.4运输保存

6.2.1待检水样经单层纱布初步过滤，去除大的杂质物。

6.2.2初过滤完的水样经5μm滤膜孔的Millipore水过滤系统进行负压过滤，留滤膜待用。

7检测

水样过滤完后，将滤膜翻转后盖于表面涂布灭活大肠杆菌的NNA培养基上，接种后置于28℃培养24h，

倒置显微镜下观察滋养体生长情况以判断培养结果。

在20倍或40倍倒置显微镜下,检查NNA平板上的虫体集落并标记,然后在涂有经灭活大肠杆菌的

NNA平板反复转接培养