流式细胞仪医学知识.ppt

;流式细胞术的基本概念;分流式细胞术的基本特点;细胞结构：包括细胞的大小、颗粒度、表面积、DNA含量及细胞周期和RNA的含量等。

?细胞功能：细胞表面或胞浆、核内的特异性抗原、细胞因子、受体；蛋白磷酸化、pH值及细胞钙例子浓度等。;流式细胞术的优势

;酶联免疫吸附测定：定量检测细胞或组织液中蛋白的表达，不能体现细胞或组织定位以及多种蛋白的共表达情况。灵敏度高，特异性低。

免疫组织化学：能直观的定位蛋白在组织中的分布，不能定量。操作步骤多，灵敏度低，假阳性率高。

免疫荧光：能直观体现蛋白的亚细胞定位，相对定量，不能同时大量检测多种不同蛋白的共表达。

免疫印迹：定性、相对定量检测细胞或组织液中蛋白的表达，不能代表蛋白的天然状态、细胞或组织定位以及两种以上蛋白的共表达情况。操作繁琐，灵敏度低。;流式细胞检测样本的制备：

细胞样本的处理：

组织样本的处理

流式细胞仪检测的信号：

散射光信号：前向角散射光（Forwardscatter，FSC)

与细胞大小有关；侧向角散射(Sidescatter，SSC，又

称90°角散射光）与细胞精细结构和颗粒性质有关，对

胞膜、胞质、核膜变化更敏感。

荧光信号：特异性荧光信号是指将荧光素分子耦联到特

异性抗体或分子上，当其与细胞表面或者胞浆中的抗原

结合后，被特定波长激发光激发而产生的信号；

自发荧光：个别的细胞有着他们各自特异性水平的自发荧光（荧光信号产生于他们自身）。;流式细胞术的常用试剂：

荧光染料：荧光染料也称荧光素，根据其应用的领域不同主要分为核酸染料和蛋白染料。

1.?核酸染料：是指能与DNA或与RNA结合的染料，它们在激光器激发的发射光能被检测器收集，主要用于检测核酸含量以及细胞周期，也可以与荧光染料两河应用，判断细胞的生物学活性。常用的有碘化丙啶（PropidineIodide,PI）、DAPI及7-氨基放线菌素D（7-AminoactinomycinD，7-AAD）等。

2.蛋白染料：蛋白染料有多种，大多数是与蛋白中的某些氨基酸基团形成稳定的结合，如CFSE是最常用的活细胞染料，也称CFDA-SE或CFDA，它与胞内蛋白赖氨酸侧链及可利用的氨基发生不可逆结合，随着细胞分裂而被减，广泛用于细胞体外增殖或是体内示踪等。除此之外，蛋白染料更为广泛的用途在于标记生物大分子，其中主要是抗体。这些抗体与染料结合以后，形成荧光抗体，与细胞表面或是胞浆中的抗原特异性结合后，经流式细胞仪检测，从而反映抗原的表达及分布情况。

这类染料主要有异硫氰酸荧光素（Fluoresceinisothiocyanate，FITC）、藻红蛋白（Phycoerythrin，PEorR-PE）、别藻红蛋白（Allophycocyanin，APC）、多甲藻叶绿素蛋白（Peridininchlorophyllprotein，PerCP）等等，目前世界上最大的荧光染料生产商当属Invitrogen旗下MolecularProbes公司。;常用荧光染料的特性;5ColorSingleLaser(488nm)

FITC/PE/ECD/PC5/PC7;流式细胞仪的工作原理;流式细胞仪的基本结构;液流系统;光学系统;流式细胞术基本原理;散射光的测量;前向散射光（FS）;侧向散射光（SS）;光散射测量的用途;荧光的测量;参数说明;1.单参数直方图;单参数直方图;2.双参数直方图;双参数直方图点图;（三）设门分析技术;任意门;线性门;十字门;开机注意事项;日常保养与维护;