DB22_T1608-2012_牛病毒性腹泻_粘膜病病毒荧光RT-PCR检测方法_吉林省.docxVIP

ICS65.020.30

B41

DB22

备案号：35742-2013

吉

林

省地方

标

准

DB22/T1608—2012

牛病毒性腹泻/粘膜病病毒荧光

RT-PCR检测方法

Methodofthereal-timeRT-PCRforthedetectionofBovineviraldiarrhea/mucosal

disease

吉林省质量技术监督局

发布

DB22/T1608—2012

前

言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由吉林出入境检验检疫局提出并归口。

本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局技术中心。

本标准主要起草人：孟庆峰、王伟利、吴连鹏、王玮琳、肖成蕊、蔡阳、宋战昀、孟日增。

I

DB22/T1608—2012

牛病毒性腹泻/粘膜病病毒荧光RT-PCR检测方法

1范围

本标准规定了牛病毒性腹泻/粘膜病病毒（bovineviraldiarrhea/mucosaldisease，BVDV）荧光

RT-PCR检测方法。

本标准适用于牛病毒性腹泻/粘膜病病毒的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3缩略语

荧光RT-PCR：荧光逆转录聚合酶链反应（RealTimeFluorescentQuantitativeReverse

TranscriptionPolymeraseChainReaction）

采用TaqMan方法，比对牛病毒性腹泻/粘膜病病毒基因组5端非编码区最保守的核苷酸序列，设计

特异性引物和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针5端标记FAM荧光素为报告荧光基团（用R表示），

3端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光基团（用Q表示），它在近距离内能吸收5端荧光基因发出的荧光信号。

PCR反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q

基因所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶的5到3的外切核酸酶功能将

探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反

应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。

除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水；所有试剂均用无RNA

酶的容器分装。

1

DB22/T1608—2012

5.1.1水：配制方法见附录A.1。

5.1.2Catrimox-14(Cat-14)。

5.1.3酚。

5.1.4三氯甲烷。

5.1.5柠檬酸钠。

5.1.6正丁醇。

5.1.7乙酸钠。

5.1.8乙醇。

5.1.9异丙醇（-20℃预冷）。

5.1.10其他试剂：AMV反转录酶(5U/μL)、RnaseInhibitor(40U/μL)、10×AMVRTPCRbuffer、MgCL2(25

mM)、dNTPMixture(各10mM)、EX-Taq酶(5U/μL)。

5.1.11引物：根据病毒性腹泻/粘膜病病毒（BVDV）国际标准株基因序列设计合成一对特异性引物：

上游引物5-CCATGCCCTTAGTAGGACTAGCA-3，下游引物5-AACCACTGACGACTACCCTGTACT-3，TaqMan探

针（FAM）5-CCATCCAACGAACTCACCACTGTTGC-3（TAMRA）均配制成20umol/L，-20℃保存。

5.2对照样品的制备

5.2.1阳性对照样品由指定单位提供或下列方法制备：将牛病毒性腹泻粘膜病国际标准毒株按10%接

种原代牛睾丸细胞，于37℃吸附1h后加入维持液（见附录A.2），37℃培养，待CPE达到70%时

收获病毒悬液，冻融2次～3次，5000r/min离心10min，取上清液备用。

5.2.2阴性对照样品由指定单位提供或下列方法制备：将生长良好的原代睾丸细胞，冻融2次-3次，

5000r/min离心10min，取上清液备用。

6.1荧光PCR检测仪。

6.2高速台式冷冻离心机（最高可达13000r/min）。

6.6二氧化碳培养箱。

7.1.1组织样品：包括肠粘膜刮取物、肾、肝、肺、淋巴结、脾、胸腺。取2g-5g组织样品切成小

块，加5mL-15mL预冷的Hanks平衡盐溶液匀浆2min，制成悬液，4℃5000r/min离心取150μL

上清液加入1mLCat-14振荡混匀