抗体的分离纯化原理和测定.pptVIP

***********************************************************************************双抗体夹心法测抗原的方法：捕获抗体包被封闭（3％BSA）待测抗原洗涤（含0.1％Tween的PBS)酶标单抗或多抗洗涤显色检测第95页，共123页，星期日，2025年，2月5日1）抗体固相测抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。方法：抗体包被封闭同时加入待测抗原和酶标抗原洗涤酶底物显色ELISAreader检测(3)竞争法测抗原第96页，共123页，星期日，2025年，2月5日2）抗原固相测抗原其原理是标本中的抗原和固相抗原与一定量的抗体竞争结合。标本中抗原含量愈多，结合在固相上的抗体愈少，最后的显色也愈浅。方法:a:抗原包被96孔板；b:封闭;c:待测抗原与抗体反应一定时间；d:加入96孔板e:洗涤f：加入酶标二抗g：洗涤h：显色和检测如临床血清样本的检测以及细胞培养上清的检测第97页，共123页，星期日，2025年，2月5日第98页，共123页，星期日，2025年，2月5日（4）IgM抗体的检测1）间接法：间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定血清中的IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部分IgM抗体不能结合到固相上，将出现假阴性结果。因此，如果用抗IgM作为二抗，间接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去IgG的干扰。方法a:抗原包被96孔酶标板；b:封闭;c:待测血清与A蛋白反应一定时间后离心d:吸取上清液加入96孔酶标板e:洗涤f：加入酶标抗IgM的抗体g：洗涤h：显色和检测第99页，共123页，星期日，2025年，2月5日（5）ABC-ELISA技术（AvidinBiotinComplex-ELISA原理亲和素是一种分子量是60，000的碱性蛋白，由四个相同亚基组成，每个亚基有一个生物素分子结合点。两者均可与抗体等大分子生物活性物质相偶联，又可被酶类等多种材料所标记，成为一种生物反应放大系统。生物素化抗体可捕获多个亲和素，后者再与酶结合，加入底物后，产生颜色反应。这一系统可以大大提高ELISA的灵敏度。操作过程：抗原包被封闭待检标本生物素化抗体洗涤酶标记亲和素洗涤加底物显色和检测第100页，共123页，星期日，2025年，2月5日EE生物素亲和素底物酶图8-11ELISA(ABC)法E第101页，共123页，星期日，2025年，2月5日（二）免疫荧光技术利用某些荧光素，如FITC(异硫氰酸酯)、RB-200(罗丹明)等通过化学反应与抗体或其它蛋白结合制备成荧光探针，然后与被测抗原或配体发生特异性结合，形成的荧光复合物在一定波长光的激发下可产生荧光，因此利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测未知抗原或相应配体。第102页，共123页，星期日，2025年，2月5日搅拌法抗体溶液逐滴加入FITC溶液搅拌4～6h离心荧光抗体制备方法第103页，共123页，星期日，2025年，2月5日搅拌法：适于体积较大，蛋白含量较高的抗体溶液优点：标记时间短，荧光素用量少缺点：影响因素多易引起较强的非特异性荧光染色第104页，共123页，星期日，2025年，2月5日透析法TITC抗体溶液FITC标记的抗体溶液反应过夜PBS第105页，共123