DB22_T2688.3-2017_饲料中三种致病菌检测微滴数字PCR法第3部分：产气荚膜梭菌_吉林省.docxVIP

ICS65.120

B25

DB22

备案号：56303-2017

吉林省地方标准

DB22/T2688.3—2017

饲料中三种致病菌检测微滴数字PCR法

第3部分：产气荚膜梭菌

DeterminationofthreepathogenicbacteriainfeedbydropletdigitalPCRmethod

Part3：Clostridiumperfringens

吉林省质量技术监督局

发布

DB22/T2688.3—2017

前

言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。

DB22/T2688《饲料中三种致病菌检测微滴数字PCR法》分为3个部分：

——第1部分：沙门氏菌；

——第2部分：单核细胞增生李斯特氏菌；

——第3部分：产气荚膜梭菌。

本部分为DB22/T2688的第3部分。

本部分中华人民共和国吉林出入境检验检疫局提出并归口。

本部分起草单位：中华人民共和国吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心。

本部分主要起草人：王准、曲辉、彭勃、罗雁非、王玮琳、李忠起、杨帆、刘金华、刘韬、李文君。

I

DB22/T2688.3—2017

饲料中三种致病菌检测微滴数字PCR法

第3部分：产气荚膜梭菌

警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问

题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。

1范围

本标准规定了饲料中产气荚膜梭菌检测微滴数字PCR法的试剂和材料、仪器和设备、样品、试验步

骤和试验数据处理。

本标准适用于饲料中产气荚膜梭菌检测的微滴数字PCR法。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB4789.1食品安全国家标准食品微生物学检验总则

GB4789.13-2012食品安全国家标准食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

微滴式数字PCR平台通过产生微小油包水体系实现反应体系的分割。经PCR扩增后，根据泊松分布原

理及阳性微滴的个数与比例得出靶分子的起始拷贝数或浓度。本标准通针特异性引物和探针进行数字

PCR扩增，从而对饲料中产气荚膜梭菌进行快速检测。

除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水应符合GB/T6682中二级水的要求。

4.1菌株：沙门氏菌阳性标准菌株。

4.5裂解液：2%CTAB(cetyltrithylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵)，100mmol/L

Tris(trishydroxymethylaminomethane，三羟甲基氨基甲烷)，1.4mol/LNaCl，20mmol/L

EDTA(ethylenediaminetetraaceticacid，乙二胺四乙酸)，用HCI调至pH8.0。

1

DB22/T2688.3—2017

4.6酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v/v）。

4.7氯仿。

4.8异戊醇。

4.9无水乙醇。

4.10异丙醇。

4.1170%乙醇。

4.12引物和探针

上有引物-5＇-CGCATAACGTTGAAAGATGG-3＇

下游引物-5＇-CCTTGGTAGGCCGTTACCC-3＇

探针-5＇-FAM-TCATCATTCAACCAAAGGAGCAATCC-TAMRA-3＇

5仪器和设备

5.1天平：感量0.01g。

5.2恒温水浴锅：46℃±1℃。

5.3微量移液器：10μL、100μL、200μL、1000μL。

5.4离心机：离心转速≥12000r/min。

5.5涡旋振荡器。

5.6核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。

5.7微滴生成仪。

5.8PCR仪。

按照GB/T14699.1对饲料进行采样（6.1），产气荚膜梭菌样品的增菌培养（6.2）按照GB4789.13

进行。

7试验步骤

在TSC培养基选取一个疑似菌落到盛有1mL无菌生理盐水的1.5mL无菌离心管中（6.3），12000r/min

离心（6.4）10min，吸弃上清；加入50μLDNA提取液（使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取），

混匀（6.5）后沸水浴5min，12000r/min离心5min。取上清保存于-20℃备用以待检测。也可使用

商业化的DNA提取试剂盒并按照其说明制备模板DNA。