DB22_T2921-2018_禽白血病A_B_J亚群检测PCR法_吉林省.docxVIP

ICS11.220

DB22

B41

吉林省地方标准

DB22/T2921—2018

禽白血病A/B/J亚群检测PCR法

DetectionmethodofPCRofavianleukosisA,BandJ-subgroups

吉林省市场监督管理厅

发布

DB22/T2921—2018

前言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。

本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。

本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院。

本标准主要起草人：曹利利、郭衍冰、董航、姚新华、苑淑贤、程荣华、邵洪泽。

I

DB22/T2921—2018

禽白血病A/B/J亚群检测PCR法

1范围

本标准规定了禽白血病A/B/J亚群PCR检测方法的技术要求。

本标准适用于禽白血病A/B/J亚群的核酸检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3试剂或材料

3.1试剂

3.1.1病毒基因组DNA提取试剂盒。

3.1.2阳性对照，为禽白血病病毒基因组DNA，或含有上述片段的质粒标准分子DNA。

3.1.3阴性对照，健康鸡血液或血清DNA。

3.1.62U/μLTaqDNA聚合酶。

3.1.11上样缓冲液，见附录A.5。

3.2.110μL、200μL和1000μL吸头。

3.2.21.5mL离心管。

引物序列、浓度及扩增长度见表1。

1

DB22/T2921—2018

表1引物序列及浓度

引物序列

引物

使用浓度

扩增长度

上游引物

F

5′-GCCAAACGGATTTCTGCCTT-3′

5′-AACCCAGATACCAAGGAACC-3′

5′-ACAGATGGACCAATTCTGTCTC-3′

5′-ATTGTTCCACAACACCTCTG-3′

AR

BR

JR

375bp

581bp

683bp

10μmol/L

下游引物

4仪器设备

4.1微量移液器，2.5μL、20μL、200μL、1000μL。

4.2电子天平，感量0.1mg。

4.3均质器。

4.4低温高速离心机。

4.5PCR扩增仪。

4.6核酸电泳仪。

用移液器（4.1）吸取抗凝血液或血清样品500μL（3.2.1）于1.5mL的离心管（3.2.2）中，以病

毒基因组DNA提取试剂盒（3.1.1）提取样本DNA，操作方法按说明书进行。

用移液器吸取鸡胚尿囊液500μL于1.5mL的离心管中，以病毒基因组DNA提取试剂盒提取样本

称取（4.2）100mg肝脏、脾脏或胰腺等组织用均质器（4.3）研碎，以病毒基因组DNA提取试剂盒

提取样本DNA，操作方法按说明书进行。

将喉拭子和/或泄殖腔拭子（3.2.3）置于1.5mL离心管中，以少量ddH2O浸润，用离心机（4.4）3000

r/min离心15min，取上清液500μL于1.5mL离心管中，以病毒基因组DNA提取试剂盒提取样本DNA，

操作方法按说明书进行。

2

DB22/T2921—2018

6试验步骤

6.1PCR扩增

分别设立以ddH2O为模板的空白对照、阳性对照（3.1.2）、阴性对照（3.1.3）和待检样品，采用

50μL反应体系，在0.2mL薄壁PCR管（3.2.4）中依次加入表2所示的试剂后，瞬时离心混匀，做好

标记，于PCR仪（4.5）中扩增。

表2PCR反应体系

成分

用量

10×PCR缓冲液（3.1.4）

dNTPs（3.1.5）

TaqDNA聚合酶（3.1.6）

引物F（3.3）

5μL

4μL

1μL

4μL

2μL

2μL

2μL

4μL

26μL

引物AR（3.3）

引物BR（3.3）

引物JR（3.3）

模板（5）

ddH2O（3.1.7）

PCR反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火1min，72℃延伸1min，

35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。

6.2.1将适量50×TAE（3.1.8）稀释成1×TAE溶液，配制溴化乙锭（3.1.9）含量为0.5μg/mL的1.0

%琼脂糖凝胶（3.1.10），见附录A.4。

6.2.2取8μ