志贺氏菌检测.docx

志贺氏菌检测

1设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其她设备和材料如下:

1、1恒温培养箱:36℃±１℃;

1、２冰箱:2℃～５℃;

１、3膜过滤系统;

1、4厌氧培养装置:４１、5℃±1℃;

1、5电子天平:感量０、

1、6显微镜:1０×～1０0×;

1、7均质器;

１、８振荡器;

1、9无菌吸管:1ｍl(具０、01ml刻度)、1０mｌ(具0、1ml刻度)或微量移液器及吸头;

1、10无菌均质杯或无菌均质袋:容量５00ｍl;

1、11无菌培养皿:直径90mｍ;

１、12pＨ计或ｐＨ比色管或精密ｐＨ试纸;

1、13全自动微生物生化鉴定系统。

2培养基和试剂

3、１志贺氏菌增菌肉汤－新生霉素:见附录中１。

3、2麦康凯(MＡＣ)琼脂:见附录中２。

３、3木糖赖氨酸脱氧胆酸盐(XＬD)琼脂:见附录中3。

3、4三糖铁(TSＩ)琼脂:见附录中4。

３、5营养琼脂斜面:见附录中5。

3、６半固体琼脂:见附录中6。

3、７葡萄糖铵培养基:见附录中７。

3、8尿素琼脂:见附录中8。

3、9β－半乳糖苷酶培养基:见附录中9。

3、10氨基酸脱羧酶试验培养基:见附录中１0。

３、11糖发酵管:见附录中11。

3、１2西蒙氏柠檬酸盐培养基:见附录中12。

3、１3粘液酸盐培养基:见附录中13。

３、14蛋白胨水、靛基质试剂:见附录中14。

3、15志贺氏菌属诊断血清。

３、１６生化鉴定试剂盒。

4操作步骤

4、1增菌

以无菌操作取检样2５g(ｍｌ),加入装有灭菌225mｌ志贺氏菌增菌肉汤得均质杯,用旋转刀片式均质器以8000ｒ/min～１００00r/ｍｉn均质;或加入装有225ml志贺氏菌增菌肉汤得均质袋中,用拍击式均质器连续均质1min～2miｎ,液体样品振荡混匀即可。于４１、5℃±１℃,厌氧培养16h～20h。

4、2分离

取增菌后得志贺氏增菌液分别划线接种于XＬD琼脂平板和MAＣ琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板上,于3６℃±１℃培养20ｈ~24h,观察各个平板上生长得菌落形态。宋内氏志贺氏菌得单个菌落直径大于其她志贺氏菌。若出现得菌落不典型或菌落较小不易观察,则继续培养至48h再进行观察。志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上得菌落特征见表1。

表1志贺氏菌在不同选择性琼脂平板上得菌落特征

选择性琼脂平板

志贺氏菌得菌落特征

MＡC琼脂

无色至浅粉红色,半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐

XLＤ琼脂

粉红色至无色,半透明、光滑、湿润、圆形、边缘整齐或不齐

4、３初步生化试验

4、3、1自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落,分别接种ＴSI、半固体和营养琼脂斜面各一管,置3６℃±1℃培养20h~

4、3、2凡就就是三糖铁琼脂中斜面产碱、底层产酸(发酵葡萄糖,不发酵乳糖,蔗糖)、不产气(福氏志贺氏菌6型可产生少量气体)、不产硫化氢、半固体管中无动力得菌株,挑取其4、3、１中已培养得营养琼脂斜面上生长得菌苔,

4、4生化试验及附加生化试验

4、４、1

用4、3、1中已培养得营养琼脂斜面上生长得菌苔,进行生化试验,即β-半乳糖苷酶、尿素、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶以及水杨苷和七叶苷得分解试验。除宋内氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌1３型得鸟氨酸阳性;宋内氏菌和痢疾志贺氏菌１型,鲍氏志贺氏菌1３型得β-半乳糖苷酶为阳性以外,其余生化试验志贺氏菌属得培养物均为阴性结果。另外由于福氏志贺氏菌6型得生化特性和痢疾志贺氏菌或鲍氏志贺氏菌相似,必要时还需加做靛基质、甘露醇、棉子糖、甘油试验,也可做革兰氏染色检查和氧化酶试验,应为氧化酶阴性得革兰氏阴性杆菌。生化反应不符合得菌株,即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集,仍不得判定为志贺氏菌属。志贺氏菌属生化特性见表2

表2志贺氏菌属四个群得生化特征

生化反应

A群:痢疾志贺氏菌

B群:福氏志贺氏菌

C群:鲍氏志贺氏菌

D群:宋内氏志贺氏菌

β－半乳糖苷酶

－ａ

－

－a

+

尿素

－

－

－

-

赖氨酸脱羧酶

－

－

-

－

鸟氨酸脱羧酶

－

-

-b

+

水样苷

－

－

－

-

七叶苷

－

-

-

－

靛基质

-/+

(+)

-／＋

-

甘露醇

－

+c

＋

＋

棉子糖

－

＋

－

+

甘油

(+)

－

(+)

d

注:+表示阳性;－表示阴性;－／＋表示多数阴性;+/-表示多数阳性;(＋)表示迟缓阳性;d表示有不同生化型。

a痢疾志贺1型和鲍氏13型为阳性。

ｂ鲍氏１3型为鸟氨酸阳性。

c福氏４型和６型常见甘露醇阴性变种。

４、4、２

由于某些不活泼得大肠埃希氏菌(aｎaerogenｉcＥ、ｃｏli)、A-D(Ａlkalｅscens-Disparbiotyｐes碱性-异型)菌得部分生化特征与志贺氏