DB22_T3298-2021_淡水鱼肠道常见致病菌分离与纯化技术规程_吉林省.docxVIP

ICS65.150

CCSB52

22

吉林省地方标准

DB22/T3298—2021

淡水鱼肠道常见致病菌分离与纯化

技术规程

Technicalcodeofpracticeonisolationandpurificationofcommonpathogenic

bacteriaofintestinalbacteriaforfreshwaterfish

吉林省市场监督管理厅

发布

DB22/T3298—2021

前

言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件中的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由吉林省农业农村厅提出并归口。

本文件起草主要单位：吉林农业大学、通化师范学院、吉林省水产技术推广总站。

本文件主要起草人：张东鸣、陈玉珂、王秋举、郭志欣、蔺丽丽、刘洪健、赵云龙、吴振超。

I

DB22/T3298—2021

淡水鱼肠道常见致病菌分离与纯化技术规程

1

范围

本文件规定了淡水鱼肠道常见致病菌分离与纯化的实验器具、试剂和培养基、准备工作、分离纯化

和记录等。

本文件适用于淡水鱼肠道常见致病菌的分离与纯化。

2

规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB4789.28食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求

SN/T2632—2010

微生物菌种常规保藏技术规程

3

下列术语和定义适用于本文件。

肠道致病菌intestinalpathogenicbacteria

注：淡水鱼肠道中常见的致病菌有：金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、嗜水气单胞菌（Aeromonas

hydrophila）、大肠杆菌（Escherichiacoli）、维氏气单胞菌（Aeromonasveronii）、爱德华氏菌（Edwardsiella）

和温和气单胞菌（Aeromonassobria）等。

4

超净工作台、显微镜（10倍×100倍）、解剖镜、离心机（RCF10000×g～30000×g）、

高压蒸汽灭菌锅（灭菌压力0kg/cm～3kg/cm）、医用冰箱（4℃～80℃）、电子分析天平（相

22

对精度1/1000）、生化培养箱（具备制冷功能）、pH计、匀浆器、恒温振荡器（往复式）、移液器（100

mL和1000mL）、漩涡混匀器（圆周震动）、酒精灯、金属接种环、玻璃涂布棒、无菌培养皿（直径90

mm）、玻璃试管（25mL）。

5

1

DB22/T3298—2021

培养基

固体和液体培养基按表1执行。琼脂仅在制作LB固体培养基时添加，培养基质量要求符合GB

4789.28的规定。

表1LB培养基

序号

成分

胰蛋白胨

酵母提取物

氯化钠

用量

10.0g

5.0g

1

2

3

4

5

10.0g

15.0g

1000mL

琼脂

蒸馏水

6

准备工作

器具消毒

将剪刀、镊子、解剖刀、培养皿、玻璃试管和锥形瓶等器具采用高压蒸汽灭菌锅高压（121℃）灭

菌20min。

将LB培养基置于锥形瓶中经高压蒸汽灭菌(121℃灭菌20min)后放置于提前灭菌的无菌操作

一只手拿锥形瓶，靠近酒精灯火焰，另一只手拔出棉塞；使锥形瓶瓶口迅速通过火焰，此步

将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，轻轻倒入厚度为3mm～5mmLB培养基，将培养

整个倒制平板过程均在超净工作台中进行。

7

分离纯化

流程图

2

DB22/T3298—2021

分离和纯化步骤见图1。

取样（见7.2）

制备悬液（见7.3）

接种（见7.4）

培养（见7.5）

纯化（见7.6）

检验纯度（见7.7）

保种（见7.8）

记录（见8）

图1

选取具有典型症状的濒死病鱼作为分离肠道致病菌的对象。用75%的酒精棉球对鱼体体表消毒

后，打开腹腔，再用75%酒精棉球擦拭肠管外壁，将整个肠道取出，分离前肠、中肠和后肠，备用。

用约2倍肠道内容物体积的无菌生理盐水将肠道内容物冲入无菌离心管中，制成细菌悬液。

将7.3.1的细菌悬液在无菌条件下涂布在LB培养基上28℃～37℃培养24h，观察菌

根据7.3.2的实验结果，在无菌条件下采用无菌的生理盐水将7.3.1的细菌悬液稀释成不同

分别取7.3.3的稀释菌液0.1