《基因与基因敲除技术》课件.pptVIP

基因编辑与基因敲除技术基因编辑与基因敲除技术是21世纪生命科学革命的焦点领域，其核心在于精准操控生物体的基因组。这些技术极大地推动了现代生物技术的发展，为疾病治疗、农业育种和基础研究开辟了新的途径。

内容结构预览技术原理探讨基因编辑和基因敲除的基本概念、历史发展和主要技术平台，包括ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9系统。实验流程详细介绍基因编辑实验的关键步骤、操作要点和效率评估方法，并通过典型案例进行说明。应用与挑战

什么是基因编辑？概念界定基因编辑是指通过生物技术手段，有目的地改变生物体DNA序列的过程。这种改变可以是精确到单个碱基的修改，也可以是大片段的重组或替换。操作方式包括插入(Insertion)：在特定位点添加新的DNA序列；删除(Deletion)：移除部分DNA片段；替换(Replacement)：用新序列替代原有序列；敲除(Knockout)：使特定基因失去功能。技术特点

什么是基因敲除？定义与原理基因敲除是基因编辑的一种重要方式，通过特定技术手段使目标基因失活或完全缺失，从而导致该基因不能表达或表达的蛋白质失去功能。研究意义通过观察基因敲除后生物体表型的变化，科学家可以确定特定基因的生物学功能、调控网络以及在疾病发生中的作用，为基础研究和临床应用提供重要信息。实现方法

基因编辑技术发展简史11972年PaulBerg和同事首次创造出重组DNA技术，将两种不同来源的DNA体外连接，开启了基因操作的新纪元。21987年MarioCapecchi等人开发出同源重组技术，实现了在哺乳动物细胞中进行基因靶向修饰，为小鼠基因敲除奠定基础。32005-2010年ZFN和TALEN技术相继问世，开创了基于蛋白质识别DNA的新型基因编辑方法，提高了基因靶向效率。42012年后张锋、丹娜·杜德纳等科学家将CRISPR/Cas9系统应用于基因编辑，因其简便高效而迅速成为主流技术，引发基因编辑研究热潮。

基因编辑与修饰的原理DNA双链断裂通过特定的核酸酶在目标位点制造DNA双链断裂细胞修复机制激活细胞启动内源性DNA修复途径处理断裂修复路径选择主要通过NHEJ或HDR两种方式进行修复基因编辑技术的核心是利用细胞自身的DNA修复机制。当编辑工具在特定位点造成DNA断裂后，细胞会启动非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)等修复机制。NHEJ效率高但准确性较低，常用于基因敲除；而HDR则需要提供修复模板，虽然效率较低但能实现精确的序列修改。

同源重组（HR）机制双链断裂DNA发生双链断裂，触发修复机制同源序列搜索断裂端寻找同源DNA模板序列复制以模板为基础合成新DNA修复完成精确恢复DNA连续性同源重组是细胞修复DNA双链断裂的一种高保真机制，主要在S和G2期发生。它利用姐妹染色单体或外源提供的同源DNA序列作为模板，精确地修复断裂位点。这一机制虽然效率相对较低（通常低于10%），但准确性极高，可以实现基因精确编辑，是基因敲入的理想途径。

非同源末端连接（NHEJ）机制1双链断裂识别Ku70/Ku80复合物结合断裂末端2修复因子募集DNA-PKcs、Artemis等蛋白质参与末端处理断裂端可能发生微小删除或插入末端连接XRCC4和DNA连接酶IV催化连接非同源末端连接是细胞修复DNA双链断裂的主要途径，几乎在细胞周期的各个阶段都处于活跃状态。与同源重组不同，NHEJ不依赖同源模板，而是直接将断裂的两端重新连接起来。由于修复过程中可能引入小的插入或缺失突变，NHEJ成为实现基因敲除的主要机制，特别适合于创建功能缺失型突变。

基因编辑主要工具概述ZFN锌指核酸酶，早期开发的基因编辑工具，由锌指蛋白（识别特定DNA序列）和FokI核酸酶（切割DNA）构成。设计复杂，特异性有限，已逐渐被新技术取代。TALEN转录激活样效应因子核酸酶，结合TAL效应因子（模块化DNA识别蛋白）和FokI核酸酶。特异性和灵活性优于ZFN，但构建耗时。CRISPR/Cas9当今最流行的基因编辑系统，利用RNA引导Cas9核酸酶进行切割。设计简便、高效、多靶点，已成为主流技术。新兴工具包括Cas12a（Cpf1）、BaseEditor（碱基编辑器）和PrimeEditor（引物编辑器）等，具有更高精度或特殊功能。

锌指核酸酶（ZFN）识别结构域锌指蛋白（ZFP）是一类含锌离子的DNA结合蛋白，每个锌指模块通常识别3个碱基对。通过组合多个锌指模块，可以特异识别9-18个碱基的DNA序列，提供靶向能力。切割结构域FokI是一种限制性内切酶，在ZFN中作为切割结构域。单独的FokI无法切割DNA，需要二聚化才能激活。因此，ZFN通常需要成对使用，以在目标位点两侧形成切口。工作机制ZFN的两个单体各自结合到目标序列附近的相对位置，使FokI二聚化并