免疫学应用技术 多克隆抗体的制备（可溶性抗原）学习资料.doc

上海师范大学

实验报告

专业、年级生物科学班级姓名学号

课程名称免疫学实验名称多克隆抗体的制备（可溶性抗原）实验日期

基本原理?

??免疫动物是通过给待免疫的动物注射抗原，使其获得相应的抗体的过程。抗原给予的方法不仅对免疫应答的起始有较大影响，而且决定着对新注射抗原的免疫吞噬和吞噬后加工处理的细胞类型，并影响对其发生免疫应答的外周淋巴器官。

材料

(一)动物：健康雄性家兔2只

(二)器材：剪刀、镊子、注射器(2ml、50ml)附针头(9号、6号)、称量瓶(10ml)、量筒、动物固定架、灭菌三角烧瓶(200ml)、手术器械一套、血管夹、黑丝线、塑料放血管等。

(三)试剂

1.灭菌生理盐水；

2.纯化人IgG(10mg／ml)；

3.消毒酒精及碘酒；

4.弗氏不完全佐剂（FCA）

5.弗氏完全佐剂（FIA）

6.弗氏完全佐剂乳化抗原(FCA-IgG)的制备：吸2mlFCA于研钵中，逐滴加入1mg／ml纯化人IgG1ml，边滴入边研磨直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上不散开为合格。

7.弗氏不完全佐剂乳化抗原(FIA-IgG)的制备：吸2mlFIA于研钵中，逐滴加入1mg／ml纯化人IgG1ml，边滴入边研磨直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上不散开为合格。

免疫方法

1.用剪刀剪去家兔两后脚掌的部分毛，以酒精及碘酒消毒皮肤；

2.第一次免疫:用2ml注射器吸取弗氏完全佐剂(FCA)乳化的抗原(人IgG)下称FCA-IgG)液1ml，每侧脚掌皮下各注入0.5ml。

3.第二次免疫：间隔14天后，于两侧腘窝及鼠蹊部肿大的淋巴结内注入FIA-IgG，每个淋巴结注0.1ml，其余注入淋巴结附近皮下共1ml。如淋巴结未肿大或肿大不明显时，直接注入两侧腘窝及鼠蹊部皮下。

4.间隔10天后，从耳静脉采血0.5～1.0ml，分离血清，以双相琼脂扩散试验测定免疫血清的抗体效价(即试血)。效价至少应达到1∶16以上时才能放血。

5.若效价未达到要求，可用不加佐剂的抗原液(人IgG)耳静脉内注射免疫。即于1周内注射3次，分别为0.1、0.3、0.5ml。间隔1周再试血。如效价达到要求应立即放血。另外,也可在第2次免疫后，以弗氏不完全佐剂(FIA)乳化的抗原(人IgG)(简称FIA-IgG)再免疫1-2次。注射部位、剂量和间隔均同第2次，再试血测抗体效价，如效价达到要求立即放血。

首次注射后一周或稍长时间再次进行加强注射，可大大增强免疫应答。

???对免疫原性弱的抗原，需要多次注射(注射5-6次)，可以在适当的时间间隔内，有效的控制抗体效价的增加。

放血

颈动脉放血

将兔仰卧，固定于兔台，剪去颈部的毛，切开皮肤，暴露颈动脉，插管，放血。放血过程中要严格按无菌要求进行。

分离血清

将三角烧瓶的血置37℃温箱1小时，再置4℃

结果鉴定

效价的测定——双向扩散法：利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩散，两者在相交处产生沉淀线，以观察和判断抗血清中是否有抗体及其浓度。

琼脂板的制备：100mlpH7.1的磷酸盐缓冲液加到1.5g的琼脂内，于水浴中加温，搅拌，使琼脂完全溶解，趁热用纱布过滤，待溶液冷却到65℃左右时，加入叠氮钠（NaN3），使其在溶液中的浓度为0.1%。用移液管把琼脂放在干净平皿或玻片上，约3mm厚，待其冷却，完全凝固后，用打孔器打孔。中央孔内加适量抗原（容量为50μl），周围各孔内分别加入50μl1：2、1：4、1：8、1：16、1：32及不稀释的抗血清，37

注意事项

1.免疫用实验动物的抗体反应性个体差异性较大，因此免疫时至少应选用两只以上动物。另外，不能使用妊娠动物。

2.免疫用的抗原必须经FCA或FIA充分乳化后才能注射，否则将明显影响抗原的免疫效果。上述制备乳化抗原的方法较费时、费力。采用H-81微型振荡混合器法或三腔管研磨法制备。前者是将抗原液与佐剂按比例混合后，置于混合器上使之剧烈振荡(频率2900转／分，振幅6mm)；后者是将免疫用的佐剂和抗原液按比例混合后，吸入注射器内再将注射器连接于三腔管上反复抽吸研磨。这两种方法约1小时即可使抗原充分乳化。

3.佐剂一方面可提高特异性免疫反应的效果获得高效价的免疫血清，但若抗原不纯时，可使抗原中极微量的污染物(0.005mgN)产生抗体，以致导致免疫血清的纯度受到影响。另外，有些实验动物种系对BCG过敏，尤其是豚鼠，当再次注射完全佐剂时,可以引起变态反应而导致免疫失败。为此，第二次免疫注射时应减少佐剂中BCG的含量或改用不完全