狂犬病阻断ELISA抗体检测技术研究及应用军事兽医研究所 流行病学研究室 张静远-狂犬病年会.pdf

狂犬病阻断ELISA抗体检测技术

研究及应用

汇报人：张静远

军事兽医研究所流行病学研究室

汇报内容

研究背景

RABV糖蛋白膜外区的稳定表达

RABV阻断ELISA抗体检测方法的建立

RABV阻断ELISA抗体检测方法的应用

研究背景

狂犬病：现无有效方法治疗，预防免疫

评价指标：血清中和抗体

0.5IU/ml

检测方法：FAVN、RFFIT——金标准

2~3个工作日、涉及病毒操作、细胞培养要求与业技术

适用亍血清抗体的大觃模监测

方便、快捷

适用亍基层的检测方法

抗原的获得？

研究一RABV糖蛋白膜外区的稳定表达

表达体系的选择

表达RABV糖蛋白膜外区的重组质粒的构建

稳定表达RABV糖蛋白膜外区的细胞系的建立

表达产物的鉴定

研究一RABV糖蛋白膜外区的稳定表达

1.表达体系的选择

狂犬病病毒

基因组RNA及5个结构蛋白

狂犬病病毒糖蛋白是目前唯一公认的诱収机体产生保护性中和抗体的蛋白

目的抗原——糖蛋白

成熟糖蛋白由3个区域组成：膜外区（抗原区）、跨膜区、膜内区

膜外区

图1-1狂犬病病毒糖蛋白结构示意图

Fig1-1ThestructureofRABVglycoprotein

研究一RABV糖蛋白膜外区的稳定表达

2.技术路线

PCR膜外区

RABVcDNA

转染

pC-SecpC-G1317

HEK293

分泌表达载体

Zeocin

压力筛选

阳性克隆

细胞表达上清细胞系的扩大培养

研究一RABV糖蛋白膜外区的稳定表达

3.重组质粒的构建

重组质粒的鉴定

bpM12

7500

5000

2500

1000

图1-2重组质粒pC-G1317的酶切鉴定

Fig1-2RestrictionenzymedigestionofrecombinantplasmidpC-G1317

M：DL15000Marker；1：空载体对照；2：重组质粒经EcoRI和HindⅢ双酶切

经测序进一步确定，RABV糖蛋白膜外区片段正确插入表达载