SZDB∕Z 335-2018 转基因玉米Bt176及其产品微滴式数字PCR定量检测方法.docxVIP

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B04

SZDB/Z

深圳市标准化指导性技术文件SZDB/Z335—2018

转基因玉米Bt176及其产品微滴式数字PCR定量检测方法

Detectionofinsect-resistantmaizeBt176anditsderivatesproductsusingdropletdigitalPCRmethod

2018-12-05发布2018-12-30实施

深圳市市场和质量监督管理委员会发布

I

SZDB/Z335—2018

目次

1范围 1

2规范性引用文件 1

3术语和定义 1

4原理 1

5试剂耗材和主要仪器 1

5.1试剂耗材 1

5.2主要仪器 2

6操作步骤 2

6.1抽样 2

6.2试样制备 2

6.3试样预处理 2

6.4DNA模板制备 2

6.5微滴式数字PCR反应 2

7数据分析 3

7.1设定阈值 3

7.2质量控制 3

7.3含量计算 3

8结果分析与表述 3

9检出限 3

II

SZDB/Z335—2018

前言

本文件依据GB/T1.1-2009规则编制。

本文件由深圳市经济贸易和信息化委员会提出并归口。

本文件起草单位：深圳市农业科技促进中心、深圳市标准技术研究院。

本文件主要起草人：邓汉超、莫洁华、李皓、侯红利、王学林、李永红、周志豪、周向阳、刘晋、周鹏、刘敏。

1

SZDB/Z335—2018转基因玉米Bt176及其产品微滴式数字PCR定量检测方法

1范围

本文件规定了转基因玉米Bt176及其产品微滴式数字PCR定量检测的原理、试剂耗材和主要仪器、操作步骤、数据分析、结果分析和表述及检出限。

本文件适用于转基因玉米Bt176及其产品的定量检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

农业部2031号公告—19—2013转基因植物及其产品成分检测抽样

农业部1485号公告—4—2010转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。3.1

zSSⅡb基因zSSⅡbgene

一种根部表达的玉米基因，本文件中用作内标准基因。3.2

Bt176结构特异性序列structure-specificsequenceofBt176

Bt176结构特异性序列为转入的抗虫基因cry1Ab与pepc-intron的边界序列。3.3

微滴式数字PCRdropletdigitalPCR

基于单模板分子PCR扩增并且对每个样品中的微滴逐个检测的一种核酸样品定量分析技术。3.4

阈值threshold

区分阳性微滴和阴性微滴的界限值。

4原理

采用玉米内标基因zSSⅡb和玉米Bt176结构特异性序列引物和探针，对测试样、Bt176阳性对照、阴性对照及空白对照进行微滴式数字PCR扩增，根据阳性对照、阴性对照和空白对照确定阳性微滴和阴性微滴的阈值，分析软件自动计算测试样zSSⅡb基因和Bt176结构特异性序列的每微升体系所含拷贝数（拷贝数浓度copies/μL）。然后根据公式：转基因含量=（Bt176拷贝数浓度/zSSⅡb拷贝数浓度）×100%，计算试样中转基因玉米Bt176的含量。

5试剂耗材和主要仪器

5.1试剂耗材

微滴式数字PCR反应试剂盒、微滴发生卡、微滴读取油、微滴生成油、96孔PCR板。引物和探针见表1。

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SZDB/Z335—2018

表1引物探针名称、序列及片段大小

引物名称

产物大小

序列（5,-3,）

zSSⅡb-F

88bp

CGGTGGATGCTAAGGCTGATG

zSSⅡb-R

AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC

zSSⅡb-P

HEX-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-BHQ1

Bt176-F

100bp

TGTTCACCAGCAGCAACCAG

Bt176-R

ACTCCACTTTGTGCAGAACAGATCT

Bt176-P

FAM-CCGACGTGACCGACTACCACATCGA-BHQ1

5.2主