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兽药体外哺乳动物细胞微核试验技术指导原则

一、概述

（一）目的

体外哺乳动物细胞微核试验是一种通过检测哺乳动物细胞经受试物处理后产生微核情况以评价受试物致突变性的方法。微核可来源于无着丝粒的染色体片段或在细胞有丝分裂后期不能迁往细胞两极的整条染色体。

本方法可用于检测在细胞暴露于受试物期间或暴露后，受试物对经历过有丝分裂的细胞诱发染色体断裂和部分非整倍体作用的活性。

为了确保兽药体外哺乳动物细胞微核试验结果的真实性、可靠性和可追溯性，根据新兽药研究的规律，结合国内兽药毒理学评价的实际情况制定了本指导原则。对偏离本指导原则的试验研究，申请人应进行解释说明。

（二）适用范围

本指导原则适用于兽用化学药物、兽用中药和兽用天然药物。消毒剂参考使用。

二、基本原则

（一）实验管理

兽药体外哺乳动物细胞微核试验须执行《兽药非临床研究质量管理规范》或《药物非临床研究质量管理规范》。

（二）具体问题具体分析

兽药体外哺乳动物细胞微核试验的设计，应在对受试物认知的基础上，遵循“具体问题具体分析”的原则。应根据受试物的结构特点、理化性质、已有的药理毒理研究信息、适应证和适用靶动物特点、临床用药方案等选择合理的试验方法，设计适宜的试验方案，并综合上述信息对试验结果进行全面分析评价。

三、试验设计

（一）细胞

可选用中国仓鼠肺（V79或CHL）细胞、中国仓鼠卵巢（CHO）细胞或原代培养细胞等进行试验。一般情况下，推荐使用CHL细胞。所使用的细胞应在生长性能、染色体数目和核型、微核自发频率等方面基本保持稳定，细胞周期时间应与公开发表的细胞特征一致。细胞系需定期检查核型和染色体数目、有无支原体污染等。

（二）受试物

化学药物：受试物应采用工艺相对稳定、纯度和杂质含量能反映临床试验拟用样品和/或上市样品质量和安全性的样品。应注明受试物名称、来源、批号、生产日期、含量（或规格）、保存条件、有效期及配制方法等，并提供质量检验报告。试验中所用溶媒和/或辅料应标明名称、标准、批号、有效期、规格和生产单位等，并符合试验要求。

中药、天然药物：受试物应采用能充分代表临床试验拟用样品和/或上市样品质量和安全性的样品。应采用工艺路线及关键工艺参数确定后的工艺制备，一般应为中试或中试以上规模的样品，否则应有充分的理由。应注明受试物的名称、来源、批号、生产日期、含量（或规格）、保存条件、有效期及配制方法等，并提供质量检验报告。由于中药的特殊性，建议现用现配，否则应提供数据支持配制后受试物的质量稳定性及均匀性。如果由于给药容量或给药方法限制，可采用原料药进行试验。试验中所用溶媒和/或辅料应标明名称、标准、批号、有效期、规格及生产单位。

在药物研发的过程中，若受试物的工艺发生变化可能影响其安全性的，应进行相应的安全性研究。

化学药物试验过程中应进行受试物样品分析，并提供样品分析报告。成分基本清楚的中药、天然药物也应进行受试物样品分析。

固体受试物应溶于或悬浮于适合的溶剂中，并稀释至适当浓度；液体受试物可直接使用或稀释至适当浓度；气体或易挥发的受试物应采用适当方法，如用封闭式容器。所用溶媒和/或辅料应选择无致突变性、不与受试物发生化学反应且不影响细胞存活和代谢活化系统活性的溶剂。

受试物应无菌，并应在无菌条件下现用现配。

（三）试验分组

试验应同时设置受试物组、阳性对照组和阴性对照组（溶剂对照和/或空白对照）。

各组均应分别在代谢活化系统存在和不存在平行条件下测试。

1.受试物组

至少应包含3个可用于结果分析的浓度。每一浓度一般平行2皿；若能获得足够细胞数，可用单皿，尤其当受试物超过3个检测浓度。

最高浓度主要取决于受试物的细胞毒性及其溶解度：

（1）对于可溶性的无细胞毒性的受试物，推荐的最高浓度一般为1mM或0.5mg/ml（选用较低者）。

（2）对于可溶性的有细胞毒性的受试物，应根据细胞毒性大小确定最高浓度。最高浓度所产生的细胞毒性应达到约50%。无细胞松弛素B（CytoB）时可通过相对群体倍增数（Relativepopulationdoubling，RPD）或相对细胞增长数（Relativeincreaseincellcount，RICC）的减少来反映细胞毒性，有CytoB时可通过分裂阻滞增殖指数（Cytokinesis-blockproliferationindex，CBPI）或复制指数（Replicationindex，RI）来反映细胞毒性。细胞毒性评价公式参见“附录（一）”。

（3）对于难溶性的受试物，若无细胞毒性，一般采用最小沉淀浓度为最高浓度；若细胞毒性出现在最小沉淀浓度以上，一般建议只检测1个沉淀浓度，因为沉淀可能产生干扰。

对最高浓度之下的其他浓度，对于细胞毒性小或无的受试物，一般浓度间距为2～3倍；对于有细胞毒性的受试物，所选择的浓度应覆盖