国产大豆转基因成分的快速检测征求意见稿.docx

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国产大豆转基因成分的快速检测环介导等温扩增（LAMP）检测法

1范围

本文件规定了国产大豆中转基因成分环介导等温扩增快速检测方法的术语和定义、原理、试剂与材料、仪器与设备、样品制备、检验方法和判定规则的要求。

本文件适用于国产大豆中转基因成分的快速检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用

文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）

适用于本文件。

GB/T19495.7-2004转基因产品检测抽样和制样方法

GB/T10362术语、定义和缩略语

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

转基因transgene

将植物本身不具有的、来源于其他物种的功能DNA序列，通过生物工程技术，使其在该物种中

进行表达，以便使该物种获得新的品种特征。

3.2

环介导等温扩增long-mediatedisothermalamplification

利用DNA聚合酶和特异性引物在恒温条件下通过循环扩增反应快速、高效地扩增目标DNA序列

的核酸扩增技术。

3.3

CP4-EPSPS

土壤农杆菌CP4蛋白基因和5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因AgrobacteriumtumefaciensstrainCP4Product:herbicidetolerantformof5-enolpyruvulshiikimate-3-phosphatesynthase。

3.4

G2-EPSPS

荧光假单胞杆菌G2蛋白基因和5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因AgrobacteriumtumefaciensstrainCP4Product:herbicidetolerantformof5-enolpyruvulshiikimate-3-phosphatesynthase。

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4原理

根据国产大豆转基因成分EP4-EPSPS及G2-EPSPS序列设计特异性内引物和外引物各一对，特异性引物碱基序列参见5试剂，表1。建立LAMP反应体系，恒温反应结束后根据添加的染料显色情况进行结果判断。

5试剂

5.1试剂

除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。

5.1.1试验用水：应符合GB/T6682中的一级水。

5.1.2CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）

5.1.31MTris-HCl（pH8.0）

5.1.40.5MEDTA（乙二胺四乙酸二钠，pH8.0）

5.1.5NaCl（氯化钠）

5.1.6dNTPs溶液：每种核苷酸浓度10mmol/L

5.1.7BstDNA聚合酶大片段（如：NEB公司或具有同等效果的DNA聚合酶）：酶浓度8U/μL。5.1.810×ThermoPolReactionBuffer：含200mmol/LTris-HCl（pH8.8）、100mmol/LKCl、

100mmol/L(NH4)2SO4、20mmol/LMgSO4、1%TritionX-100。

5.1.9MgSO4溶液：150mmol/L。

5.1.10甜菜碱溶液：5mol/L。

5.1.11酚红溶液：10%。

5.1.12引物：CP4-EPSPS/G2-EPSPS环介导等温扩增（LAMP）检测方法作用引物见表1。

表1LAMP反应引物序列

序号

基因名称

引物序列（5’-3’）

1

CP4-EPSPS

F3

CGTACCATCCGTCTTGAAGG

B3

AGACGTGGGTTGATCACTTC

FIP(F1c+F2)

GCAGCAACCAATGGGAAAGCGAGTGGTAAGCTCACCGGTCA

BIP(B1c+B2)

CAGGTTCCGACGTCACCATCCCACCCATTTCCTGCAGAGTC

2

G2-EPSPS

F3

GCACGCTTTATCGTTGACGT

B3

CGGTCACGGTTTTCTGCG

FIP(F1c+F2)

AACACGCCATGCTTGTCGAGTGTCGCGAGCAAGCTCTGC

BIP(B1c+B2)

GCCTGATGATTCGGGTCCGCCTCAAGGTACAAGGCTCCTG

5.2溶液配制

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5.2.1裂解液量取10mL1MTris-HCl（pH8.0）、0.8mLEDTA（pH8.0）、81.86gNaCl、2gCTAB加入烧杯中，加入约800mL超纯水，搅拌溶解。用稀盐酸或NaOH调节pH至8.0，