《杂交苜蓿种子真实性鉴定SSR分子标记法》.docx

ICS65.120

B40

团体标准

T/HXCYXXX-2025

杂交苜蓿种子真实性鉴定SSR分子标记法

AuthenticityIdentificationofHybridAlfalfaSeedsbySSR

（征求意见稿）

202X-XX-XX发布202X-XX-XX实施

北京华夏草业产业技术创新战略联盟发布

T/HXCYxxx—2025

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目次

TOC\o1-1\h\z\u前言 II

1范围 1

2规范性引用文件 1

3术语和定义 1

4缩略词 2

5原理 2

6仪器设备 3

7所需试剂 3

8引物 3

9试验步骤 4

10数据统计记录 7

11结果分析 7

杂交苜蓿种子真实性鉴定SSR分子标记法

1范围

本文件规定了SSR分子标记法鉴定杂交苜蓿种子真实性的术语和定义、仪器设备、实验步骤、结果分析等内容。

本文件适用于杂交苜蓿种子真实性鉴定、品种的审定、新品种知识产权保护及种子市场监管。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T2930.4《草种子检验规程发芽试验》

DB62/T4094《草品种真实性检验规程SSR标记法》

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1简单重复序列simplesequencerepeat(SSR)

是由1-6个核苷酸为基本单位，通过连续串联重复形成的DNA片段，长达通常在几十个至几百个bp之间，又称微卫星序列或短串联重复序列，重复单元的数量在不同个体或物种中高度可变，形成多态性标记，是遗传分析的重要工具。

3.2琼脂糖凝胶电泳agarosegelelectrophoresis

是一种基于分子大小分离DNA片段的常用分子生物学技术。琼脂糖凝胶电泳利用琼脂糖凝胶作为介质，在电场作用下，使带负电的核酸分子（DNA）从负极向正极迁移，通过凝胶孔径的分子筛效应，实现不同大小核酸片段的分离。分离后的核酸可通过染色进行可视化分析。

3.3聚合酶链式反应polymerasechainreaction(PCR)

是一种在体外快速扩增特定DNA片段的分子生物学技术，通过模拟DNA天然复制过程，实现目标序列的指数级扩增。DNA双链变性：高温（约95℃）使双链DNA解链为单链模板；引物退火：降温（通常是55℃～65℃）使特异性引物与单链DNA的互补区域结合；链延伸：中温（约72℃）下，DNA聚合酶以单链为模板，按照碱基互补配对原则，以5→3方向合成新链；重复循环上述步骤，实现DNA指数增长。

3.4引物primer

是人工合成的短核苷酸序列（通常在18bp～30bp），能够通过碱基互补配对与模板DNA特异性结合，引导DNA聚合酶从3端开始合成新链。

3.5聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamidegelelectrophoresis(PAGE)

是一种基于分子大小、电荷或构象分离DNA的高分辨率电泳技术。以聚丙烯酰胺凝胶为介质，通过交联聚合反应，利用电场驱动带电分子迁移。

4缩略词

下列缩略语适用于本文件。

bp:basepair，碱基对

DNA：deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核苷酸

DNAmarker:用于比较DNA片段大小的标准工具

TBE：电泳缓冲液

Taq酶：Taq-DNApolymerase，耐热DNA聚合酶

dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸

ddH2O：双蒸水（超纯水）

LoadingBuffer：上样缓冲液

5原理

因基因组存在着能够世代遗传的简单重复序列，杂交种子具有双亲等位标记互补带型。根据父母本的特征分子标记对应在杂交种中的谱带，可判断该杂交种的真伪性。SSR分子标记技术因其多态性高、重复性好、操作简便等特点，是遗传分析的重要工具。设计特异引物，利用PCR技术进行扩增，扩增产物利用电泳进行分离，分析其长度多态性，达到杂交苜蓿种子真实性鉴定。

6仪器设备

高压灭菌锅、台式冷冻高速离心机、恒温水浴锅（30-100℃）、超纯水仪、电子天平、凝胶成像系统、PCR扩增仪、电泳仪、垂直电泳槽及配套制胶工具、摇床、磁力搅拌器等。

7所需试剂

所用试剂均为分析纯。

7.1DNA提取

使用植物基因组DNA提取试剂盒进行DNA的提取。（液氮、研钵等）

7.2琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖、核酸染料、乙二胺四乙