医学科研中常见的实验技术介绍.pptxVIP

医学科研中常见的实验技术介绍本演示将全面介绍医学科研中的核心实验技术，涵盖从细胞培养到数据分析的各个环节。适合医学研究人员、生物科技工作者及相关学科学生参考学习。作者：

目录细胞培养技术无菌操作、细胞传代与冻存、原代细胞培养等基础技术。分子生物学技术PCR技术、基因克隆、基因表达分析及基因编辑等核心方法。蛋白质相关技术蛋白质提取、定量、WesternBlot以及免疫组化等技术。其他重要领域组织学技术、动物实验技术及数据分析与统计方法。

细胞培养技术概述技术重要性细胞培养是医学研究的基础。它为疾病机制研究提供了可控的实验系统。基本原理模拟体内环境，为细胞生长提供适宜条件。控制温度、湿度和气体组成是关键。应用领域药物筛选、疫苗研发、毒理学研究和组织工程都依赖细胞培养。基础研究中也是不可或缺的工具。

无菌操作技术超净工作台准备开启紫外灯30分钟。擦拭台面75%酒精消毒。所有物品表面酒精喷洒灭菌。个人防护工作前洗手消毒。穿着专用实验服，戴无菌手套。操作全程避免说话和快速移动。无菌操作要点保持移液管尖端无接触。容器开口朝向气流。迅速盖紧未使用的试剂瓶盖。

细胞传代与冻存细胞消化胰蛋白酶-EDTA处理。控制时间避免过度消化。显微镜下观察细胞形态变圆时终止。传代比例确定根据细胞增殖速率确定传代比例。通常肿瘤细胞1:5，原代细胞1:2。细胞冻存使用含10%DMSO的培养基。缓慢降温至-80℃。长期保存转入液氮。细胞复苏迅速解冻。立即稀释去除DMSO。24小时后更换培养基。

原代细胞培养1组织获取手术切除或活检组织立即放入冰冷PBS。动物实验中无菌取出目标器官。2组织消化机械剪碎结合酶消化。胶原酶、弹性蛋白酶等根据组织类型选择。3细胞分离细胞筛网过滤去除碎片。离心收集细胞。特殊细胞可用磁珠分选。4培养特点生长速度慢。传代次数有限。形态和功能更接近体内状态。

分子生物学技术概述研究核酸DNA/RNA的结构与功能研究。基因组测序与分析。1基因表达转录与翻译调控。基因表达谱分析。2基因修饰基因编辑与操作。基因治疗策略开发。3临床应用分子诊断。个性化医疗的基础。4分子生物学技术是现代医学研究的核心，它揭示了疾病的分子机制，为精准医疗提供了科学依据。

PCR技术PCR原理利用DNA聚合酶体外扩增特定DNA片段。包括变性、退火和延伸三个主要步骤。需要模板DNA、引物、dNTPs和耐热DNA聚合酶。PCR类型与应用传统PCR：基因检测和克隆实时定量PCR：基因表达分析巢式PCR：提高灵敏度多重PCR：同时检测多个靶点

基因克隆技术1目标基因获取PCR扩增或酶切消化2载体准备质粒酶切和纯化3连接反应DNA连接酶催化4转化感受态细胞热激法或电转化5阳性克隆筛选抗生素筛选和PCR验证基因克隆技术是获得大量特定基因的重要方法，为后续的基因功能研究和蛋白表达奠定基础。

基因表达分析RNA提取TRIzol法或柱纯化提取总RNA。确保无DNA污染和RNA降解。RNA质量用琼脂糖凝胶电泳或生物分析仪检测。反转录逆转录酶将RNA转换为cDNA。可使用随机引物或oligo(dT)引物。避免二次污染很重要。qPCR分析SYBRGreen或TaqMan探针法进行定量。内参基因校正至关重要。相对定量使用2^-ΔΔCt方法计算。

基因编辑技术1CRISPR/Cas9高效精准的基因组编辑工具2TALENs转录激活因子样效应物核酸酶3ZFNs锌指核酸酶4同源重组传统基因编辑方法CRISPR/Cas9系统由向导RNA和Cas9蛋白组成，通过识别特定DNA序列并切割靶点实现基因编辑。基因敲除用于功能丧失研究，基因敲入可引入特定突变或外源基因。

蛋白质相关技术概述蛋白质研究是理解生命活动的关键。蛋白质作为功能执行者参与几乎所有生理病理过程。现代蛋白质组学技术实现了高通量蛋白质分析。

蛋白质提取与纯化细胞裂解根据目标蛋白选择裂解方法。膜蛋白需要去垢剂处理。核蛋白需要特殊核提取方案。组织研磨液氮冷冻研磨最常用。匀浆器或组织研磨仪也可选择。研磨过程防止蛋白降解很重要。纯化技术层析是主要纯化手段。亲和层析特异性最高。离子交换和凝胶过滤也常用。超速离心可分离亚细胞组分。

蛋白质定量技术Bradford法基于考马斯亮蓝G-250与蛋白结合后颜色变化原理。操作简便快速。显色稳定性好。主要缺点是对BSA敏感度高，不同蛋白间存在偏差。BCA法基于二价铜离子被蛋白还原为一价铜，与BCA试剂生成紫色络合物。对去垢剂耐受性好。线性范围广。缺点是需要加热反应。其他方法紫外吸收法简单但易受杂质干扰。Lowry法灵敏但操作复杂。各种方法应根据样品特点选择。

WesternBlot技术1蛋白质电泳SDS胶分离蛋白。浓缩胶和分离胶结构。电压通常80-120V。2转膜电转移至PVDF或硝酸纤维素膜。湿转或半干转选择。冰盒冷却