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三、基因操作的基本步骤

三、基因工程操作的基本步骤从细胞中分离出DNA从大肠杆菌中提取质粒限制酶提取目的基因限制酶目的基因与运载体结合DNA连接酶目的基因导入受体细胞目的基因的检测与表达

基因操作“四部曲”——即四个基本步骤：01提取目的基因02目的基因于运载体结合03将目的基因导入受体细胞04目的基因的检测和表达

1提取目的基因2目的基因是人们所需要转移或改造的基因,获取目的基因是实施基因工程的第一步。3如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。

目的基因的提取方法1直接分离基因人工合成基因2反转录法根据已知的氨基酸序列合成DNA3：鸟枪法4

用限制酶切断成许多片段1.鸟枪法（散弹射击法）用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞提供的外源DNA的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制（即扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再利用一定发方法将目的基因的DNA片段分离出来。

（2）基因文库的建立方法提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与运载体连接导入受体菌中储存基因组文库方法一：直接分离法(鸟枪法)

2.人工合成基因法1）反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。目的基因的mRNA单链DNA(cDNA)双链DNA(即目的基因)反转录合成

2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法：根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成

上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点缺点鸟枪法反转录法根据已知氨基酸合成DNA法操作简便广泛使用工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因专一性强操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高专一性最强仅限于合成核苷酸对较少的简单基因

DNA序列自动测序仪：PCR技术：对提取出来的基因进行核苷酸序列分析。使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？

目的基因与运载体结合用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。

将目的基因导入受体细胞常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。将目的基因导入受体细胞的原理借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。

①直接导入法有电击、显微注射、直接吸收、基因枪等方法。（1）电击法：借助电击仪高压脉冲把目的基因打入宿主细胞。（2）显微注射法：利用微量注射器在显微镜下直接把目的基因注入宿主细胞。（3）直接吸收法：把目的基因和宿主细胞混在一起，让其吸收。（4）基因枪法：在金属微粒上涂一层目的基因，然后发射到宿主细胞中。②间接导入法常用的载体是质粒、λ噬菌体、科斯质粒。（1）质粒是细菌染色体DNA以外的环状双链DNA分子，它能自我复制，也可整合到细胞染色体DNA中与其一起表达。质粒通常还含有标记基因，这可以从细胞的表型特征来识别。（2）λ噬菌体是一种细菌病毒，其环状双链DNA可以作为目的基因的载体。（3）科斯质粒是一种杂种质粒，含有质粒和λ噬菌体的部分顺序，很适合用作真核生物基因的载体。

1.将目的基因导入植物细胞

2.将目的基因导入动物细胞

将细菌用CaCl2处理，以增大细菌细胞壁的通透性。使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。例如：将目的基因导入微生物细胞12

步骤四：目的基因的检测和表达四环素抗性基因氨苄青霉素抗性基因检测是否导入：看标记基因控制的性状是否表现

检测是否表达：不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。01看目的基因控制的性状是否表现04受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？02若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。03

例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表