芜菁种质资源鉴定技术规程.docxVIP

DB63/TXXXX-2024

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63ICS65.020.01

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ICS65.020.01

CCSB04

备案号：

青海省地方标准

青海省地方标准

发布青海省市场监督管理局2025—XX—XX实施2025—XX—XX发布芜菁种质资源鉴定技术规程

SSR分子标记法（征求意见稿）

发布

青海省市场监督管理局

2025—XX—XX实施

2025—XX—XX发布

芜菁种质资源鉴定技术规程

SSR分子标记法

（征求意见稿）

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前言

本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由青海省农牧业标准化技术委员会提出。

本文件由青海省农业农村厅归口。

本文件起草单位：青海大学、青海省农林科学院、玉树藏族自治州农牧业综合服务中心。

本文件主要起草人：任延靖、李全辉、尕桑、文军琴、邵登魁。

本文件由青海省农业农村厅监督实施。

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芜菁种质资源鉴定技术规程

SSR分子标记法

范围

本文件规定了利用简单重复序列（Simplesequencerepeats,SSR）标记进行芜菁（Brassicarapassp.rapaL.）种质资源鉴定的仪器设备及试剂、溶液配制、操作程序及判定方法。

本文件适用于芜菁种质资源数据的采集和资源的鉴定。

规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

仪器设备及试剂

仪器设备

高压灭菌锅；研磨仪；干燥箱；移液器；电热恒温水槽；低温高速离心机；超纯水系统；微波炉；水平电泳槽及其制胶套件；电泳仪；制冰机；凝胶成像系统；聚合酶链式反应（PCR）仪；胶片观察灯；天平；垂直电泳槽及其制胶套件；核酸定量测定仪；超低温冰箱；涡旋混合器；磁力加热搅拌器；水平摇床等。

试剂

十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）；β-巯基乙醇（β-ME）；酚：氯仿：异戊醇（25:24:1，pH=8.0）；氯仿：异戊醇（24:1）；乙醇；琼脂糖；含有染料的2×PCR预混液；SSR引物；核酸染料；DNA标准分子量；丙烯酰胺，N,N-亚甲基双丙烯酰胺；四甲基二乙胺（TEMED）；过硫酸铵，硝酸银；氢氧化钠；甲醛溶液（37%）；三羟甲基氨基甲烷（Tirs）；乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）；硼酸，本文件所用的试剂和水，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和GB/T6682中规定的三级水。

溶液配制

溶液配制方法见附录A。

操作程序

样品选择

选取芜菁幼嫩、无病虫害的叶片，每份样品包含5～9份叶片的混合样，并设置三个重复。

DNA样品制备

DNA提取方法及步骤如下：

选取约0.2g叶片组织样本至于干净的、装有2粒直径为6mm灭菌钢柱的2mL离心管中，防入液氮中速冻后，使用高通量组织研磨仪迅速研磨至粉末，时间60s。

向离心管中加入710μL65℃预热1h的1.5×CTAB提取液，混匀样品粉末和提取液；将离心管放入65℃烘箱或水浴锅中温浴30min，中间每间隔5min轻摇一次。

取出离心管，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）的混合物，轻摇10min充分混匀，10,000g/min室温离心10min。

取上层液相700μL转移于无菌的1.5mL离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），轻摇10min充分萃取杂质，12,000g/min室温离心10min。

取上清清液500μL，加入2倍体积的预冷无水乙醇，颠倒混匀，-20℃条件下沉淀30min，4℃条件下6,000g/min离心2min。

以上为推荐的DNA提取方法，DNA质量能满足PCR扩增要求的其他DNA提取方法均适用于本标准。DNA溶液的紫外吸光度OD260与OD280的比值宜介于1.7～2.0。

PCR扩增

引物选择

选择附录B中的引物进行扩增。

反应体系

PCR反应体系为20.00μL，包括200ng/μLDNA模板1.00μL，10mol/L上、下游引物各0.80μL，2×TaqPCRMix10.0μL，用超纯水补足至20.0μL，可以依据试验条件调整。

PCR扩增程序

PCR扩增程序：95℃预变性5min