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蛋白质含量测定——双缩脲试剂法实验报告

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生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称蛋白质含量测

定双缩脲试剂法实验日期实验地点合作者指导老师评分教师签名

批改日期

1、实验目的

1、1、掌握双缩脲测定血清总蛋白的基本原理、操作；

1、2、掌握双缩脲试剂的配制；

1、3、熟悉血清总蛋白的临床意义；

1、4、了解双缩脲法测定血清总蛋白的特点和注意事项。

二、实验原理

2、1、两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-

NH2），因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与Cu2+发

生双缩脲反应，生成紫红色络合物。

2、2、蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同

样能在碱性条件下与Cu2+发生双缩脲反应，生成的紫红色络合

物，且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10～120g/L范围内

有良好的线性关系。

三、材料与方法：

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3、1、实验材料：

3、1、1、实验试剂：①小牛血清；②

6、0mol/LNaOH溶液；③双缩脲试剂:硫酸酮、酒石酸钾钠、

碘化钾；④蛋白质标准液（70g/L）；⑤0、9%NaCl；⑥蒸馏水。

3、1、2、实验器材：①试管；②烧杯；③容量瓶；④加样

枪；⑤刻度吸管；⑥玻璃棒；⑥1100分光光度计；⑦电子天平；

⑧水浴锅。

3、2、实验步骤取3支试管，做好标记，按下表操作：

加入物（ml）B（空白）S（标准）U（待测）小牛血清

（1:10）0、5蛋白质标准液（1:10）0、9%Nacl0、5双缩脲试

剂

4、0

4、0

4、0a、各管混匀，观察各试管颜色；b、将各试管置于37℃

水浴锅中加热20mi，观察颜色；c、将试管中的液体倒入比色杯

中，置于1100分光光度计的样品槽内，在波长540nm，以空白管

调零，测S和U管吸的光度；d、测定结束后，将比色杯中的样品

回收进试管。

依据公式算出结果：

四、结果与讨论：

4、1、实验现象：①选取三支洁净无损的试管，从左往右依

次加入0、9%氯化钠溶液、蛋白质标准液、相应的小牛血清各0、

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5ml，分别命名为B试管、S试管和U试管，再分别向三支试管内

加入4ml的双缩脲试剂，溶液均成蓝色透明状。②将三支试管放

入37℃水浴锅中加热20min，取出后，B试管呈淡蓝色，S试管和

U试管均成浅紫色，且S试管的颜色比U试管的颜色深。（如图

一）图一水浴后三支试管颜色图二

分光计读数测定次数

4、2、实验数据123平均吸光度管号管号S0、1850、184

0、1850、1847U0、1520、1510、1520、1517结果计算：代

入公式：血清总蛋白（g/L)=(Au/As)X蛋白质标准液浓度（g/L)，

得出结果：血清总蛋白=

57、493g/L。

4、3、结果讨论经查阅资料得：正常成人血清总蛋白含量为

60～80g/L，而小牛血清总蛋白含量比正常成人血清总蛋白含量略

低一点，本次结果得出小牛血清总蛋白含量为

57、493g/L，符合情况。

4、3、1、成功原因：①本次试验的试剂混合水浴后出现了预

期效果：B试管呈淡蓝色，S试管和U试管均成浅紫色，且S试管

的颜色比U试管的颜色深。B试管呈淡蓝色是因为B试管中没有发

生任何反应，所以呈现双缩脲试剂本来的淡蓝色，而S试管和U

试管呈浅紫色是因为试剂中的蛋白质和双缩脲发生了双缩脲反应

而呈浅紫色。②吸光度测试后得到的数据，经计算后得到了预期

中的结果，是因为前面操作严谨。

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4、3、2、误差分析①三次重复测定过程中出现了一些浮动数

据，可能是因为仪器本身存在的可允许的误差范围。②第一次尝

试使用分光光度计的时候得到了负值，经查明是因为放置在其内

的比色杯将磨面对准了通光