基因克隆的酶学基础.pptVIP

DNA聚合酶I聚合活性第60页，共107页，星期日，2025年，2月5日DNA聚合酶I的5’-3’核酸外切酶活性第61页，共107页，星期日，2025年，2月5日2．E.coliDNA聚合酶Ⅰ的用途切口平移法（nicktranslation）标记DNA所有DNA聚合酶中只有此酶有此反应5’3’Mg2+,DNaseIdNTP,DNApolyI切口平移第62页，共107页，星期日，2025年，2月5日探针标记双链DNA分子由DNaseI产生的单链缺口,带有3’OH末端大肠杆菌DNA聚合酶I的5’3’外切酶活性从缺口5’-P一侧移去一到数个核苷酸大肠杆菌DNA聚合酶I将32P标记的核苷酸掺入取代原先被删除的核苷酸重复进行?和(d),使缺口沿着5’3’方向移动.第63页，共107页，星期日，2025年，2月5日（二）、KlenowDNA聚合酶

E.coliDNApolymeraseⅠlargefragment（Klenowfragment）??大肠杆菌DNA聚合酶I经蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解而从全酶中除去5‘--3’外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和3‘--5’外切活性不受影响，分子量为76kDa。

第64页，共107页，星期日，2025年，2月5日活性：与E.coliDNA聚合酶Ⅰ的活性是一致的。但没有5‘--3’外切活性作用：①补平3凹端DNA。要加足够的dNTP②抹平DNA3凸端。必须加足量dNTP③在cDNA克隆中合成第二链。④随机引物标记。????⑤应用于Sanger双脱氧链末端终止法的DNA测序（已经被T7DNA聚合酶取代）????第65页，共107页，星期日，2025年，2月5日DNA分子末端标记第66页，共107页，星期日，2025年，2月5日（三）、T4噬菌体DNA聚合酶（T4phageDNApolymerase）来源于T4噬菌体感染的E.coli，分子量为114kDa活性：与Klenow酶相似，但3‘--5’外切活性强200倍5’—3’聚合活性第67页，共107页，星期日，2025年，2月5日用途①用于补平或标记3‘凹端②取代合成（需高浓度dNTP一种)-末端标记③标记DNA片段利用外切活性产生3‘凹端再补平第68页，共107页，星期日，2025年，2月5日（四）、T7噬菌体DNA聚合酶（T7phageDNApolymerase）来源于T7噬菌体感染的E.coli，为两种紧密结合的蛋白质复合体，一种是噬菌体基因5蛋白，另一个是宿主蛋白的硫氧还蛋白。聚合能力最强的DNA聚合酶；聚合过程中不形成二级结构；可进行单纯的延伸或取代合成的途径；在从5‘到3’方向的聚合过程中也有一定程度的3’?5’核酸外切酶活性；将双链DNA5’或3’突出末端转变成平末端的结构。第69页，共107页，星期日，2025年，2月5日活性：与T4噬菌体DNA聚合酶和KlenowDNA聚合酶类似，但3‘--5’外切活性为Klenow的1000倍。用途：T7噬菌体DNA聚合酶可替代T4的功能并可用于长模板的引物延伸。

第70页，共107页，星期日，2025年，2月5日修饰的T7DNA聚合酶切除了99%以上的3‘--5’外切活性（V1）完全除去V2用于测序反应第71页，共107页，星期日，2025年，2月5日（五）、耐热DNA聚合酶在高温下有DNA聚合活性，来自噬高温的细菌，主要用于PCR反应，如TaqDNA聚合酶、VentDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶、PwoDNA聚合酶和TthDNA聚合酶等第72页，共107页，星期日，2025年，2月5日（六）、反转录酶（Reversetranscriptase）依赖于RNA的DNA聚合酶，也叫做RNA指导的DNA聚合酶或反转录酶。活性：有5‘--3’合成DNA活性来自AMV（禽成髓细胞瘤病毒）或Mo-MLV（鼠白血病病毒，又称M-MuLV）第73页，共107页，星期日，2025年，2月5日?AMV反转录酶包含两条多肽链；具5‘--3’DNA聚合活性很强的RNA酶H活性（降解与DNA杂交的RNA）在cDNA合成开始时，引物和mRNA模