动物疫病鉴别检测技术 禽腺病毒Ⅰ群与禽腺病毒Ⅲ群 .docxVIP

1

动物疫病鉴别检测技术禽腺病毒I群与禽腺病毒Ⅲ群

1范围

本文件描述了禽腺病毒I群与Ⅲ群聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction,PCR)的鉴别检测方法。

本文件适用于含有禽腺病毒I群与Ⅲ群的鉴别检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4试验原理

PCR技术是在TaqDNA聚合酶作用下，以靶DNA为模板、靶DNA序列5端与3端互补的且长度一般为18bp～27bp的特异性寡核苷酸为引物、dNTP为反应原料，按照碱基配对及半保留复制原理，经变性、

退火、延伸循环多次，DNA扩增产物呈指数型上升，并通过X脂凝胶电泳获知扩增产物的分子量从而判XX果。本文件对禽腺病毒I群与Ⅲ群靶基因进行PCR扩增，并通过特异性扩增产物分子量差异，用于禽腺病毒I群与Ⅲ群的鉴别检测。

5试剂或材料

除非另有说明，所用试剂均为分析纯。

5.1水：GB/T6682,一级。

5.210000×核酸荧光染料(GelRed/GelGreen)。

5.3DL2000DNA分子标准：包括100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp分子量标准。

5.4PCR反应试剂：10×TaqDNA聚合酶缓冲液、TaqDNA聚合酶(5U/μL)、dNTP(2.5mmol/L);2×PCR反应预混液(2×TaqPCRMix)。

5.5磷酸盐缓冲液(PBS):0.01mol/L、pH7.4。

称取氯化钠(NaCl)8.0g、氯化钾(KC1)0.2g、磷酸二氢钾(KH?PO?)0.2g、磷酸氢二钠(Na?HPO?

·12H?O)2.9g,依次溶于800mL水中，用盐酸调pH值至7.4,于高压灭菌锅121℃灭菌20min,4℃保存。

5.60.5mol/LEDTA溶液：pH8.0。

称取EDTA18.61g,加灭菌水至80mL,用氢氧化钠调pH至8.0,充分溶解，定容至100mL,室温保存。

5.71×TAE缓冲液。

2

取20mL50×TAE电泳缓冲液，加灭菌水至1000mL,室温保存。

5.81.5%X脂糖凝胶。

称取X脂糖1.5g,放入100mL1×TAE电泳缓冲液中，加热融化，温度降至50℃~60℃时，加入10μL10000×核酸荧光染料(GelRed/GelGreen),均匀铺板，厚度为3mm～5mm。

5.96×核酸电泳加样缓冲液。

称取EDTA4.4g、溴酚蓝0.25g、二甲苯腈蓝FF0.25g,依次溶于200mL灭菌水中，加入180mL甘油，调pH值至7.0,定容至500mL,分装室温保存。

5.10病毒DNA提取试剂盒。

5.11无核酸酶离心管(1.5mL)。

5.12PCR检测反应管(0.2mL)。

5.13禽腺病毒I群4型、禽腺病毒Ⅲ群EDSV阳性对照样品和阴性对照样品，均-20℃保存。阳性对照：禽腺病毒I群4型、禽腺病毒Ⅲ群EDSV基因组DNA;阴性对照：SPF鸡肝脏组织。

5.14引物：引物名称和序列按照附录A执行。

6仪器设备

6.1A型Ⅱ级生物安全柜。

6.2电子天平：精度0.01g。

6.3高速冷冻离心机：转速≥12000r/min。

6.4微型低速离心机：转速≤6000r/min。

6.5冰箱：-20℃。

6.6PCR检测仪。

6.7凝胶成像仪。

6.8电泳仪、电泳槽。

6.9高压灭菌锅。

7样品

样品采集、保存和运输按照NY/T541执行。

8试验步骤

8.1样品处理

8.1.1肝脏组织样品

在A型Ⅱ级生物安全柜中处理。使用电子天平称取1.00g±0.05g样品，剪碎后与PBS按1:5(W/V)比例混合，研磨成组织匀浆，装入1.5mL无核酸酶离心管，置于高速冷冻离心机，4℃、12000r/min离心5min,取上清液提取核酸。

8.1.2拭子样品

置于50