分子生物学研究法-食品伙伴网（原食品伴侣网）关注食品安全，.pptxVIP

第五讲分子生物学研究法;一、重组DNA技术发展史上的重大事件

二、基因操作的主要技术原理

三、分子克隆技术

四、DNA的Microarray

;一、重组DNA技术发展史上的重大事件;1869?FMiescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。

1944O.T.Avery证实DNA是遗传物质。

1952A.D.Hershey和M.Chase再次证实和噬菌体的遗传物质是DNA。

1953J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子结构的双螺旋模型。M.Wilkins用X-射线衍射法证实了这一结构。

1957?A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。

1958?M.Meselson和F.W.Stahl提出了DNA的半保留复制模型。

1959-1960S.Ochoa发现RNA聚合酶和信使RNA，并证明mRNA决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。;1961Nirenberg破译了第一相遗传密码；F.Jacob和J.Monod提出了调节基因表达的操纵子模型。1964?C.Yanofsky和S.Brenner等人证明，多肽链上的氨基酸序列与该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。

1965?S.W.Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由“质粒”DNA所决定。

1966?M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破译了全部遗传密码。

1970H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。;1972-1973?H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。

1975-1977?F.Sanger与A.Maxam、W.Gilbert等人发明了DNA序列测定技术。

1977年完成了全长5387bp的噬菌体φ174基因组测定。

1978?首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。

1980美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以专利化。

1981R.D.Palmiter和R.L.Brinster获得转基因小鼠；A.C.Spradling和G.M.Rubin得到转基因果蝇。;1982美、英批准使用第一例基因工程药物--胰岛素；Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。

1983?获得第一例转基因植物。

1984?斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。

1986?GMO首次在环境中释放。

1988?J.D.Watson出任“人类基因组计划”首席科学家。

1989DuPont公司获得转肿瘤基因小氧--“Oncomouse”。

1992?欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定(315kb);1994第一批基因工程西红柿在美??上市。

1996完成了酵母基因组(1.25×107bp)全序列测定。

1997英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。

;基因工程中常见的名词:

遗传工程--geneticengineering，基因操作--gonemanipulation，基因克隆--gonecloning，

重组DNA技术--recombinantDNAtechnology，分子克隆--molecularcloning。;基因工程的主要内容或步骤:

1.从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。

2.将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。

3.将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。

4.从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。

5.将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。;;二、基因操作的主要技术原理;;在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）--ethidiumbromide染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ngDNA所形成的条带。

??DNA的脉冲电泳技术:PFGE-Pulse-fieldgelelectrophoresis;2．核酸的分子杂交技术

???在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都是在杂交之前，通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地吸印转移到滤膜上的。常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（