白斑综合征病毒(WSSV)环介导等温扩增(LAMP)检测技术规范.docxVIP

白斑综合征病毒(WSSV)环介导等温扩增(LAMP)检测技术规范

范围

本标准规定了白斑综合征病毒（WSSV）环介导等温扩增（LAMP）检测的基本要求、试剂、仪器设备、操作步骤、结果判定和质量控制等内容。

本标准适用于对虾及相关养殖环境中白斑综合征病毒的快速检测。

规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

NY/T896水产用化学药品、抗生素残留物的测定高效液相色谱法

术语和定义

白斑综合征病毒（WSSV）

是一种感染对虾的杆状、有囊膜的双链DNA病毒，可引起对虾的白斑综合征，具有高致病性和高死亡率。

环介导等温扩增（LAMP）

是一种新型的核酸扩增方法，通过设计针对靶基因的4条或6条特异性引物，在具有链置换活性的DNA聚合酶作用下，在等温条件（通常60-65℃）下实现核酸的高效、快速扩增。

基本要求

实验室环境

检测实验室应分为样品处理区、试剂准备区、扩增及产物检测区，各区域应保持相对独立，避免交叉污染。实验室应保持清洁、通风良好，温度和湿度应符合实验要求。

人员要求

操作人员应经过专业培训，熟悉LAMP检测技术的原理、操作流程和质量控制要求。在操作过程中，应严格遵守实验室安全规程和生物安全要求，穿戴好工作服、手套、口罩等防护用品。

试剂

引物

-引物设计：根据WSSV的保守基因序列设计4条LAMP特异性引物，包括两条内引物（FIP和BIP）和两条外引物（F3和B3）。引物应具有良好的特异性和扩增效率。

-引物合成：引物由专业的生物技术公司合成，合成的引物应进行质量检测，确保其纯度和浓度符合要求。

-引物保存：引物用TE缓冲液（pH8.0）溶解，配制成一定浓度的储存液，-20℃保存。使用前，可将储存液稀释成工作液，4℃短期保存。

反应试剂

-无菌去离子水：符合GB/T6682一级水的要求，用于配制反应体系。

-2×反应缓冲液：包含Tris-HCl、KCl、MgSO?、(NH?)?SO?等成分，提供适宜的反应环境。

-镁离子溶液：一般使用25mmol/L的硫酸镁溶液，用于调节反应体系中的镁离子浓度。

-dNTPs混合液：包含dATP、dTTP、dCTP和dGTP，每种dNTP的浓度为10mmol/L。

-BstDNA聚合酶：具有链置换活性，用于催化DNA的合成。酶的活性单位应符合要求，应在-20℃保存。

-阳性对照模板：用已知的WSSV阳性样品提取的DNA作为阳性对照模板，其浓度应经过标定。

-阴性对照模板：用健康对虾组织提取的DNA或无菌去离子水作为阴性对照模板。

核酸提取试剂

-裂解液：含有蛋白酶K、SDS等成分，用于裂解细胞，释放核酸。

-酚-氯仿-异戊醇（25∶24∶1）：用于去除蛋白质等杂质，纯化核酸。

-无水乙醇：用于沉淀核酸。

-70%乙醇：用于洗涤沉淀的核酸。

-TE缓冲液（pH8.0）：用于溶解沉淀的核酸。

仪器设备

核酸提取设备

-离心机：具有冷冻功能，最大转速不低于12000r/min，用于分离和沉淀核酸。

-恒温金属浴或水浴锅：温度精度为±0.5℃，用于核酸提取过程中的孵育步骤。

LAMP扩增设备

-恒温扩增仪：能够精确控制反应温度在60-65℃，温度波动范围不超过±0.5℃。

-旋涡振荡器：用于混合反应试剂。

产物检测设备

-凝胶成像系统：用于观察和分析LAMP扩增产物的凝胶电泳结果。

-比色管或离心管：用于观察反应产物的颜色变化。

操作步骤

样品采集与处理

-样品采集：采集疑似感染WSSV的对虾组织，如鳃、肝胰腺、肌肉等，每个样品至少采集3只虾。同时，采集养殖环境样品，如水样、底泥等。

-组织处理：将采集的对虾组织用无菌剪刀剪碎，加入适量的裂解液，用组织匀浆器匀浆，制成组织匀浆液。

-水样处理：取适量的水样，4000r/min离心10min，取上清液，再以12000r/min离心20min，弃上清，沉淀用于核酸提取。

-底泥处理：称取适量的底泥，加入无菌生理盐水，振荡混匀，4000r/min离心10min，取上清液，按水样处理方法进一步处理。

核酸提取

-步骤

-取200μL组织匀浆液、水样沉淀或底泥处理后的上清液于1.5mL离心管中，加入20μL蛋白酶K和200μL裂解液，振荡混匀，56℃孵育30-60min