剧毒鹅膏菌的物种鉴别PCR扩增Sanger测序法.docxVIP

种剧毒鹅膏菌的物种鉴别PCR扩增Sanger测序法

剧毒鹅膏菌是引起误食中毒死亡的主要类群。物种鉴别对于预防误食中毒以及准确开展毒蘑菇研究具有重要意义。PCR扩增Sanger测序法能通过对特定DNA区域进行扩增和测序，基于核酸序列分析来较精准地鉴别剧毒鹅膏菌物种。

实验材料与试剂准备

样本采集与保存

从疑似剧毒鹅膏菌生长的自然环境中，使用洁净的工具（如镊子、剪刀）采集子实体样本。选取具有代表性的组织，如菌盖、菌柄等部位，尽量避免污染其他杂菌。将采集的样本迅速放入含有硅胶干燥剂的密封袋中，以快速干燥样本，预防样本DNA降解。也可将样本直接置于-80℃低温冰箱中冷冻保存，用于后续分析。

试剂与耗材准备

1.基因组DNA提取试剂：包括CTAB提取液（含有十六烷基三甲基溴化铵、氯化钠、Tris-HCl、EDTA等成分）、氯仿-异戊醇（24:1）混合液、异丙醇、70%乙醇、TE缓冲液等。

2.PCR反应相关试剂：TaqDNA聚合酶、dNTP混合液（包含dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、PCR缓冲液、引物（常用的如ITS、LSU等区域的特异性引物）、无菌去离子水。

3.其他试剂：琼脂糖、溴化乙锭（EB，或安全型核酸染料）、1×TAE缓冲液（用于配制琼脂糖凝胶电泳液）、6×上样缓冲液。

4.耗材：微量移液器及吸头（10μL、200μL、1000μL）、离心管（1.5mL、0.2mL）、PCR管、凝胶加样枪头、分液漏斗等。

实验设备准备

1.高速低温离心机：用于DNA提取过程中的离心操作，要求具备较高的转速和能维持低温环境，以保证DNA的完整性。

2.PCR仪：能精确控制温度变化，用于进行PCR扩增反应，其温度控制精度需在±0.5℃以内。

3.制冰机：为实验过程中需要低温操作的步骤提供冰块。

4.水平式琼脂糖凝胶电泳槽及电源：用于检测PCR扩增产物，能保证DNA片段在电场中稳定移动。

5.凝胶成像系统：用于观察和拍摄琼脂糖凝胶上的DNA条带，需具备高分辨率的成像功能。

6.掌上型漩涡震荡器：用于混合溶液，使样本与试剂充分混匀。

7.电子天平：用于准确称量试剂和样本，精度达到0.0001g。

8.酸度计：用于调节试剂的pH值，保证其在合适的酸碱度范围内。

实验步骤

基因组DNA提取

1.样本处理：从保存的样本中取约20-30mg的组织，放入1.5mL的离心管中，加入适量的液氮，迅速用研磨棒将组织研磨成粉末状，尽量避免研磨过程中样本升温导致DNA降解。

2.CTAB法提取DNA

-向研磨好的样本中加入600μL的CTAB提取液，涡旋振荡混匀，置于65℃水浴锅中保温30-60分钟，期间每隔10-15分钟轻轻颠倒混匀一次，使CTAB与样本充分作用，释放基因组DNA。

-取出离心管，冷却至室温后，加入等体积（约600μL）的氯仿-异戊醇（24:1）混合液，轻轻颠倒混匀，然后在12000rpm的转速下离心10-15分钟。此时，离心管内形成三层，上层为含DNA的水相，中层为蛋白等杂质的沉淀层，下层为氯仿层。

-将上层的水相转移至新的1.5mL离心管中，注意不要吸取到中间层和下层液体。加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，可见白色絮状的DNA沉淀析出，将离心管置于-20℃冰箱中放置30分钟，促进DNA沉淀。

-在12000rpm转速下离心15分钟，弃去上清液，收集DNA沉淀。加入1mL的70%乙醇，轻轻颠倒洗涤沉淀2-3次，去除残留的盐分和杂质，然后在12000rpm转速下离心5分钟，弃去上清液，室温晾干沉淀，直至乙醇完全挥发。

-向干燥的DNA沉淀中加入50-100μL的TE缓冲液，置于4℃冰箱中过夜，使DNA充分溶解。

3.DNA质量检测：取2-5μL的DNA溶液，加入适量的1×TAE缓冲液和6×上样缓冲液，混匀后进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。电泳条件为1×TAE缓冲液，电压100-120V，电泳时间30-40分钟。将电泳后的凝胶放入凝胶成像系统中观察，若能看到清晰、明亮且大小合适的条带，说明DNA提取质量较好。用核酸蛋白分析仪检测DNA的浓度和纯度，A260/A280应在1.7-2.0之间，A260/A230应大于2.0，表明DNA纯度较高，无蛋白质和盐类等杂质污染。

PCR扩增

1.引物选择与设计：根据检测目的，选择合适的DNA区域作为扩增目标。对于剧毒鹅膏菌的物种鉴别，常用的是核糖体DNA内转录间隔区（ITS）和大亚基（LSU）等区域。可从相