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悬浮细胞冻存技术规范
演讲人：
日期:
目录
CATALOGUE
02
冻存前准备
03
标准冻存流程
04
冻存质量控制
05
长期保存管理
06
复苏与后续处理
01
技术概述
01
技术概述
PART
悬浮细胞冻存定义
01
悬浮细胞冻存
将悬浮在培养液中的细胞，通过特定的程序降温，使其在极低温度下保存，同时保留其生物学特性和功能。
02
细胞株保存
对于珍贵、难以获取或具有特殊生物学特性的细胞株，冻存是长期保存的重要手段。
应用场景与适用范围
细胞治疗产品制备过程中，需要将细胞株进行长期保存，以便随时制备和使用。
细胞治疗
在基础研究和临床研究中，建立细胞库是常见手段，冻存技术可以长期保存细胞。
细胞库建立
在细胞转运过程中，利用冻存技术可以确保细胞在长时间内保持活性和功能。
细胞转运
冻存必要性分析
资源共享
冻存技术使得细胞资源可以在不同地区、不同实验室之间共享，促进科学研究和技术进步。
03
长期传代培养可能导致细胞发生变异，冻存可以减少变异风险。
02
减少细胞变异
细胞特性维持
冻存可以保持细胞的生物学特性，如细胞形态、增殖能力、分化能力等。
01
02
冻存前准备
PART
细胞状态评估标准
细胞活力
细胞形态
细胞数量
无污染
细胞活力是评估细胞状态的重要指标，需保证细胞活力在90%以上。
细胞形态正常，无明显变形或异常。
细胞数量适宜，悬浮细胞密度均匀。
确保细胞无细菌、真菌、支原体等微生物污染。
培养基更换与洗涤
更换培养基
在冻存前，需更换为适合冻存的培养基，以保证细胞在冻存过程中不受营养缺乏的影响。
01
洗涤细胞
使用无菌的PBS等缓冲液洗涤细胞，去除残留的血清和培养基成分，以减少冰晶的形成。
02
离心处理
洗涤后进行离心处理，去除上清液，使细胞沉淀在离心管底部。
03
常用的保护剂包括二甲基亚砜（DMSO）、甘油等，这些物质能够降低冰点，减少冰晶形成，保护细胞免受损伤。
冻存保护液配制方法
保护剂选择
保护剂的浓度需适当，DMSO一般使用浓度为5-10%，甘油使用浓度为10-20%。
保护剂浓度
将保护剂与培养基混合均匀，注意避免产生气泡，配制好的冻存保护液需预冷至4℃后再使用。
配制过程
03
标准冻存流程
PART
离心参数与细胞收集
6px
6px
6px
根据细胞类型和状态设定，通常使用100~1000×g的离心力。
离心速度
使用吸管或移液器将上层培养基和悬浮细胞小心转移到无菌离心管中。
细胞收集
根据离心力和细胞特性确定，一般为5~10分钟。
离心时间
01
03
02
使用细胞计数器进行细胞计数，确保细胞密度适宜。
细胞计数
04
冻存管分装操作规范
冻存管选择
分装细胞
密封与标记
预冷处理
选用高质量的、无菌的、密封性好的冻存管，通常为1.5~2.0mL的规格。
将调整好密度的细胞悬液分装入冻存管中，每管分装量应不少于0.5mL。
旋紧管盖，确保密封性良好，并在管身标记细胞名称、代数、冻存日期等信息。
将冻存管放入4℃冰箱中预冷30分钟，以减少后续降温对细胞的损伤。
降温速率
采用程序降温仪或手动操作，降温速率应控制在-1℃/分钟左右。
温度梯度
从4℃开始降温，逐步降至-40℃左右，以避免细胞内结冰导致的细胞损伤。
低温保持
在-40℃或更低温度下保持一段时间（如2~4小时），以确保细胞充分冷冻。
转移至液氮罐
将冻存管转移至液氮罐中长期保存，注意在转移过程中保持低温环境。
程序降温步骤设计
04
冻存质量控制
PART
细胞存活率检测
细胞计数
使用细胞计数仪或血球计数板对冻存前后的细胞进行计数，比较存活率。
01
存活率检测
采用台盼蓝拒染法、荧光染色法等方法检测细胞存活率，确保冻存后的细胞存活率符合要求。
02
形态学观察
通过显微镜观察细胞形态，判断细胞是否健康、完整。
03
微生物污染排查
采用培养法或PCR法检测细胞中的细菌污染情况。
细菌检测
使用真菌培养基或荧光染色法检测细胞中的真菌污染。
真菌检测
采用ELISA、PCR等方法检测细胞中的病毒污染，确保细胞安全。
病毒检测
冻存记录标准化
复苏后记录
记录复苏后的细胞存活率、形态、生长情况等，以便评估冻存效果。
03
详细记录降温速度、最终温度、冻存时间等关键参数。
02
冻存过程记录
冻存前记录
记录细胞名称、数量、来源、冻存条件等信息。
01
05
长期保存管理
PART
液氮罐存储规范
选择能够承受极低温度且保持良好密封性的液氮罐，确保细胞在长时间内处于恒定低温环境。
合适的液氮罐
罐内温度监控
罐体位置稳定
定期检查并记录液氮罐内部温度，确保温度维持在-196℃左右。
液氮罐应放置在固定且稳定的位置，避免受到撞击或倾斜。
定期活性检测周期
细胞活性检测
每隔一定时间（如半年或一年），取少量冻存细胞
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