第一章基因工程学概论.pptVIP

??????????????????????????????????????????????????????????????????第94页，共163页，星期日，2025年，2月5日3.平末端连接：不含3’或5’突出优点：可连接任何一对DNA可恢复一个酶切位点或产生一个新酶切位点缺点：连接率低要求连接酶及底物浓度高第95页，共163页，星期日，2025年，2月5日4.T-A克隆第96页，共163页，星期日，2025年，2月5日四、重组DNA的转化第97页，共163页，星期日，2025年，2月5日1.基本概念转化（transformation）：把以质粒为载体构建的重组DNA，在一定条件下引入受体细胞的过程。转染（transfection）：以噬菌体或病毒构建的重组DNA引入受体细胞的过程。转化子：又称工程菌，即接受了重组DNA的受体菌。第98页，共163页，星期日，2025年，2月5日2.受体细胞及感受态感受态：细胞最易摄取和“容忍”外来DNA的生理状态。致敏：诱导细胞进入感受态的操作。感受态细胞的特点：接受DNA的位点暴露；膜通透性增加；修饰酶活性最高，限制酶活性最低受体细胞处于非增殖阶段第99页，共163页，星期日，2025年，2月5日３．转化方法1）氯化钙转化法2）电转化法第100页，共163页，星期日，2025年，2月5日4.转化规律载体分子愈小，转化率越高环状DNA分子较线型DNA分子转化率高1000倍新鲜制备的（对数生长的）幼嫩细胞转化易成功。第101页，共163页，星期日，2025年，2月5日五、重组体筛选、鉴定与克隆扩增第102页，共163页，星期日，2025年，2月5日平板筛选插入失活插入表达电泳筛选PCR筛选核酸杂交DNA测序免疫学检测法1.常用筛选/鉴定阳性重组体的方法初步筛选精确鉴定第103页，共163页，星期日，2025年，2月5日1.平板筛选法（1）插入失活（insertionalinactivation)：在载体的基因编码序列中，当某个限制性内切酶作用位点上插入外源DNA后，其活性失去，不能表达相应的功能。常以此现象作为标记，筛选被这种重组体转化的细胞。第104页，共163页，星期日，2025年，2月5日第105页，共163页，星期日，2025年，2月5日第106页，共163页，星期日，2025年，2月5日结果分析：1.AmpsTets（转化失败）2.AmprTetr（转化成功，但无重组）3.AmprTets（重组、转化均成功）第107页，共163页，星期日，2025年，2月5日H2NCOOH???-galactosidaseOntheplasmidOnthechromosome(DH5α,TOP10)蓝白斑选择：LacZ第108页，共163页，星期日，2025年，2月5日E.coliengineeredforBlue/WhiteScreening(DH5α,TOP10)chromosome??-gal??-galMCSNonfunctionalNonfunctional?-Complementation第109页，共163页，星期日，2025年，2月5日第110页，共163页，星期日，2025年，2月5日第111页，共163页，星期日，2025年，2月5日IPTG+beta-gal第112页，共163页，星期日，2025年，2月5日第113页，共163页，星期日，2025年，2月5日（2）插入表达（insertionalexpression)载体设计时，筛选标志基因前连接一段负控制序列（抑制），当目的DNA插入该点使其抑制作用失活时，其下游筛选标志才能表达。第114页，共163页，星期日，2025年，2月5日CI为负控制序列（抑制Ter表达），DNA插入CI失活,Tet表达。第115页，共163页，星期日，2025年，2月5日2.电泳法筛选分离转化菌质粒，酶切电泳，根据DNA分子大小不同，鉴别真正重组体DNA，排除假阳性（如载体自我连接载体双重体）该法不能鉴别插入片段大小相似的非目的基因片段的假阳性。第116页，共163页，星期日，2025年，2月5日联合酶切鉴定同源末端连接重组子中DNA插入片段的方向