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QIAGENEpiTect?Bisulfite
重亚硫酸盐处理DNA时，需要经高盐浓度、高温和低PH条件，会导致DNA断裂和片段化，并在随后的纯化过程中丧失，所以需要大量的inputDNA
重亚硫酸盐转化未甲基化的胞嘧啶，转化率超过99%
BisulfiteMix足够做8个反响，用时要将BisulfiteMix溶于800μlRNase-freewater中，溶解的BisulfiteMix在-20℃可以保存4周
DNAProtectBuffer能保护重亚硫酸盐处理的DNA在高温、低ph条件下被片段化
CarrierRNA能提高小量DNA〔小于500pg，体积大于40μl〕绑定在回收柱滤膜上的效率，帮助核酸沉淀；总量大于100ng的基因组DNA没有必要加CarrierRNA
EpiTectBisulfiteKit在-20℃可以保存3年；可以适用于大范围的DNA量，inputDNA范围为1ng~2μg；模板DNA片段范围可以在500bp~30kb之间
Protocol
DNA量在1ng~2μg之间，体积20μl以上
开始前的准备重点：
BisulfiteMix足够做8个反响，如果样本少于8个，可以把溶解的BisulfiteMix保存于-20℃，4周内并不会影响其性能
DNAProtectBuffer在参加DNA–BisulfiteMix后会由绿变蓝〔step2〕，说明溶液混合很充分且PH值正确
所有的离心别离步骤均在室温〔15–25°C〕下完成
开始前准备的东西：
参加30ml乙醇〔96%~100%〕到BufferBW中，室温〔15–25°C〕保存，使用之前摇匀
参加27ml乙醇〔96%~100%〕到BufferBD中，2~8℃保存，使用之前摇匀，使用之后要立即盖上盖子。储存一段时间后底部可能会出现白色沉淀，沉淀不影响BufferBD的性能，但是还是要防止将沉淀吸到回收柱中。
参加310μlRNase-freewater到冻干的carrierRNA〔310μg〕中，配成1μg/μl的溶液。当一次处理48个样本，将溶解的carrierRNA参加到BufferBL的瓶子中，摇匀并确认瓶盖标签。如果处理的样本较少，那么将溶解的carrierRNA分装，并储存于-20℃，分装的carrierRNA能保存1年。如果少于48个样本要在2周之内完成处理，那么参照表1的体积比取一定体积的BufferBL与carrierRNA混合。DNA量大于100ng不需要加carrierRNA。如果BufferBL有沉淀，那么需加热〔最高不超过70℃〕并温和搅拌使其溶解。
表1BufferBL与carrierRNA的体积比
室温平衡样本和Buffers
实验流程
重亚硫酸盐转化DNA
融化DNA备用，溶解BisulfiteMix，参加800μlRNase-freewater，混匀5min使其完全溶解。如有必要，60℃加热并混匀BisulfiteMix–RNase-freewater溶液使其溶解。注意不要将溶解的BisulfiteMix置于冰上。
在200μl离心管中配制重亚硫酸盐转化反响液，参照表2配制反响体系，DNA体积缺乏20μl那么用RNase-freewater补足。〔处理低浓度DNA〔1~500ng或小于500pg〕时，DNA体积增加到40μl，DNAProtectBuffer减少为15μl，总体积140μl不变〕
表2重亚硫酸盐转化反响体系
盖上PCR管盖，混匀反响液，置于室温〔15–25°C〕。DNAProtectBuffer在参加DNA–BisulfiteMix后会由绿变蓝，说明混匀充分且PH值正确。
在循环加热器上进行重亚硫酸盐转化DNA反响，反响条件参照表3。整个反响过程需要5h。
表3重亚硫酸盐转化反响条件
将PCR管放入循环加热器中，开始转化反响。注意PCR管中不要参加矿物油，保证管盖密封。已经转化的DNA可以在循环加热器中保存过夜，不会影响其性能。
纯化重亚硫酸盐转化的DNA
待转化反响完成之后，取出PCR管，瞬时离心，再将PCR管中的反响液转到一个1.5ml的干净的离心管中。转移反响液不影响其性能。
在每个样本中参加560μl现配的BufferBL〔参照表1参加10μg/mlcarrierRNA〕，涡流混匀并瞬时离心。如果DNA大于100ng，那么不需要参加carrierRNA。〔处理FFPE样本或DNA量小于500pg的样本时，参加现配的BufferBL的体积减少为310μl〔参加10μg/mlcarrierRNA〕，混匀离心，之后再参加250μl96~100%乙醇，混匀15
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