项目三细胞体外培养任务二培养细胞观察51课件.pptx

项目三细胞体外培养任务二培养细胞观察食品药品系王家利

细胞培养细胞的冻存和复苏

细胞低温冷冻贮存（通常用液氮贮藏，温度可达－150～－196度）是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。为什么进行细胞冻存？液氮罐细胞培养

在体外培养工作中，常要将体外培养物进行冷冻保存，在需要时再复温融解进行体外培养（复苏）。细胞培养什么是细胞复苏？

如何获得好的冻存和复苏效果？细胞培养冷冻速率：慢冻（？）复苏速率：快融（？）冷冻保护剂：5－15％二甲基亚砜（DMSO）或甘油（？）冷冻保存温度：－196 ℃（液氮）

当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶，冰晶导致细胞损伤甚至死亡。二甲基亚砜或甘油可使冰点降低，在缓慢冻结条件下，可使细胞内水分逐步透出，避免大的冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。融化速度快，还可使迅速通过最易受损的-5－0度。细胞培养冻存和复苏的原则：慢冻快融

为什么要加低温保护剂？细胞培养二甲基亚砜或甘油易穿透细胞，使冰点下降，提高胞膜对水的通透性，使细胞内的水分渗出细胞外，在胞外形成冰晶，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。细胞冻存时，二甲基亚砜或甘油使用浓度范围在5～15％之间，常用10％的浓度。

如何进行细胞冻存？1.预先配制冻存液：（1）90%完全培养基（含10%－20％血清）＋10%DMSO或甘油；（2）90%血清＋10%DMSO或甘油2.取对数生长期细胞，经胰酶消化（或离心）后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（5×106～1×107细胞/ml)3.加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。细胞培养

如何实现慢冻？标准程序：当温度在-25℃以上时， 1～2℃/min（4℃冰箱存放30min）当温度达-25℃以下时，5～10℃/min（-20℃冰箱存放1.5-2h）当温度达-80℃时，可迅速放入液氮中（-80℃冰箱存放4-12h）转入液氮罐，注意登记！简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2℃的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。细胞培养

将冻存管放入液氮罐中的用具细胞培养

如何进行细胞复苏？（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38 ℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。（2）室温下，5分钟内用25度左右血清培养液稀释至原体积的10倍以上。（3）低速（800-1000rpm）离心10分钟。（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。每日观察细胞生长情况，若死细胞较多，次日应换液。细胞培养

①配制0.4％台盼蓝：0.4g台盼蓝加热溶于100ml PBS液中，贴标签。②制备细胞悬液:将培养细胞制成细胞悬液，计数后调整细胞浓度在l×106个/ml左右。③染色：取少量细胞悬液，按1：l量加入0.4％台盼蓝溶液，充分混匀，静置1～2min，制片镜检。活细胞圆形透明，死细胞染成蓝色。细胞培养如何进行细胞活性检查？

制片时用胶头滴管吸取细胞悬液，从计数板边缘缓缓滴入，使之充满计数板和盖玻片之间的空隙。注意不要使液体流到旁边的凹槽中或带有气泡，否则需重做。1min后用10×物镜移动视野观察，计数100～200个细胞。用活细胞占计数细胞中的百分比表示细胞活力。细胞培养

如何运输细胞？1、长距离运输（几天）（1）选择生长良好的单层细胞，去掉培养液，补充新培养液至瓶颈部，保留微量空气，拧紧瓶盖。这样可避免由于液体晃动导致细胞损伤。（2）瓶口用胶带密封，并用棉花包裹瓶身（防震防压），放在携带者贴身口袋。（3）到达目的地后，吸出多余的培养液，保留细胞生长所需液量。2、短距离运输（几小时）去掉大部分生长液，仅留少量液体覆盖单层细胞，防止细胞干燥，将细胞面朝上带回。细胞培养