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例析几种与PCR技术应用相关的教学疑难点

陈国龚一富

（1.浙江省慈溪中学浙江宁波315300）

（2.宁波大学海洋学院浙江宁波315832）

PCR技术是生物学考试中的热点与难点。近年来，随着PCR技术的快速发展，除常规PCR外，还衍生出了重叠延伸PCR、反向PCR、荧光定量PCR、巢式PCR、不对称PCR、多重PCR等技术，不同的PCR技术有着不同的应用。下文选取了教学中与PCR技术相关的疑难点，并结合典型试题，探讨几种PCR技术的应用，以促进学生对PCR技术的理解，并为教师的教学提供参考。

获取目的基因是基因工程操作的第一步。新版高中生物学教材介绍了化学合成、借助载体建立基因文库和通过PCR扩增DNA三种获取目的基因的方法。由于PCR是体外的DNA扩增技术，部分学生在学习时，对如何利用PCR技术获取目的基因存在疑问。

【例1】“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1A所示。经4轮循环后产物中有5种不同的DNA分子，如图1B所示，其中第⑤种DNA分子有（）个。

图1目的基因及PCR产物

参考答案：8

难点分析：若要获得目的基因X，至少需要3轮PCR，具体过程如图2所示。第一轮PCR得到2个DNA片段（①和②各一分子）。第二轮PCR得到4个DNA片段（①②③④各一个）。第三轮PCR得到8个DNA片段（①②各1个，③④⑤各2个），其中⑤是等长的，即获得2个目的基因X。同理，第四轮PCR可得到16个DNA片段，其中8个⑤，实现了目的基因的扩增。

图2PCR获取目的基因

检测目的基因在受体细胞内是否稳定存在是基因工程操作的重要步骤。新版高中生物学教材介绍了借助载体上的标记基因、PCR技术和核酸分子杂交技术等方法鉴定受体细胞中是否转入了目的基因。在实际操作中，PCR技术不仅可精准地鉴定受体细胞是否转入目的基因，还可以通过引物的巧妙设计鉴定目的基因的连接方式。

【例2】为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图3中A所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是____。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段，原因是______________。

图3重组质粒

参考答案：乙和丙目的基因反向连接

难点分析：可以运用PCR技术检测鉴定受体细胞中是否转入目的基因，其简要的步骤是，首先根据目的基因的序列设计PCR引物，接着利用待检DNA为模板进行PCR，再通过电泳鉴定PCR产物。如图3所示，如果用引物乙和丙，若正确连接则会产生350bp片段，反向连接则不会出现；同理，若用引物甲和丙，无论正向连接还是反向连接均会产生450bp片段。根据图3中B进行分析，若采用引物甲和乙，目的基因反向连接会扩增出400bp片段。

随着PCR技术的不断创新，在实验中，可利用重叠延伸PCR技术引导基因定点突变，重叠延伸PCR技术是如何将两个不同来源的DNA片段拼接的，也是学生普遍关心的问题。下面结合例题进行分析。

【例3】水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺（密码子为AAC、AAU）替换为赖氨酸（密码子为AAA、AAG），从而提高水蛭素的抗凝血活性，原理如图4所示。

图4PCR定点突变示意图

（1）若拟突变位点的碱基对为A-T，则需要让其突变为_____才能达到目的。引物2的突变位点（突起处）应设计为______（假设引物为单链DNA）。

（2）在第一阶段获得两种具有重叠片段DNA的过程中，引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制，共产生__________种DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中，这是因为_________________。

（3）利用重叠延伸PCR技术还可以将两个不同来源的DNA片段拼接起来。有人想利用该技术把基因M和N拼接在一起，设计基因M的引物M1、M2，基因N的引物N1、N2。在设计这4种引物时，特别要注意的问题是___________________________。

参考答案：（1）T-A或C-GA或G（2）3引物2和引物3中存在互补片段，置于同一反应体系时会发生结合而失去作用（3）M1、M2中的一种引物与引物N1、N2的其中一种必须具有互补配对的片段

难点分析：利用重叠延伸PCR技术实现基因定点突变的设计思路分为两步。第一步是重叠，即用具有互补配对片段的引物（图4中的引物2和3）分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段