PCR技术及其应用课件.pptVIP

PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72℃第1輪結束第2輪開始PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72℃第2輪結束PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點重複30輪後230=1,073,741,824範本DNA第1輪擴增第2輪擴增第3輪擴增第4輪擴增第5輪擴增第6輪擴增理想拷貝數=2nn迴圈次數實際拷貝數=(1+x)nX平均效率,約為0.85n迴圈次數（三）PCR反應PCR反應條件PCR過程PCR的特點靈敏度高皮克(pg=10-12)量級擴增到微克(ug=10-6)水準能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞病毒檢測的靈敏度可達3個RFU細菌檢測的最小檢出率為3個細菌簡便、快速一次性加好反應液，2～4小時完成擴增擴增產物一般用電泳分析對標本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛髮、細胞、活組織等組織的粗提DNA1.PCR反應成分（1）範本單、雙鏈DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結合蛋白類。一般100ngDNA範本/100?L。範本濃度過高會導致反應的非特異性增加。（四）PCR反應體系（2）引物濃度0.1-0.5?mol/L濃度過高易導致範本與引物錯配,反應特異性下降。（3）TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)0.5-2.5U/50?l酶量增加使反應特異性下降;酶量過少影響反應產量。（4）dNTPdNTP濃度取決於擴增片段的長度四種dNTP濃度應相等濃度過高易產生錯誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應產量dNTP可與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的啟動劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應體系。Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產量下降；Mg2+過高影響反應特異性。Mg2+可與負離子結合，所以反應體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應中游離的Mg2+濃度。2.迴圈參數(1)變性使雙鏈DNA解鏈為單鏈95oC20-30秒(2)退火溫度由引物長度和GC含量決定。增加溫度能減少引物與範本的非特異性結合;降低溫度可增加反應的靈敏性。（3）延伸70-75oC，延伸時間由擴增片段長度決定（4）迴圈次數主要取決於模版DNA的濃度一般為25-35次次數過多：擴增效率降低錯誤摻入率增加（五）PCR引物的設計一般原則1.引物長度一般以18～30bp為宜，過短則降低特異性，過長則會引起引物間的退火而影響有效擴增，同時也增加引物合成的成本。2.避免引物內部出現二級結構，避免序列內有較長的回文結構，使引物自身不能形成髮夾結構。3.G/C和A/T堿基均勻分佈，G+C含量在40～60%之間，引物堿基序列盡可能選擇堿基隨機分佈，避免出現嘌呤或嘧啶連續排列。4.要避免兩個引物間特別是3`末端堿基序列互補以及同一引物自身3`末端堿基序列互補的，使它們不能形成引物二聚體或髮卡結構。5.引物3`末端堿基一般應與範本DNA嚴格配對，並且3`末端為G、C或T時引發效率較高。6.引物5`末端堿基可不與範本DNA匹配，可添加與範本無關的序列(如限制性核酸內切酶的識別序列、ATG起始密碼子或啟動子序列等)，便於克隆和表達，但其保護堿基有一定的要求。7.引物的堿基順序不能與非擴增區有同源性。（六）PCR中應注意的事項1.防止污染試劑小量分裝吸頭及EP管一次性使用器皿及工作區域要分開，無菌操作2.設立對照：陽性對照：陽性範本陰性對照：陰性範本試劑對照：除範本外的所有組分二PCR技術應用（一）PCR技術的主要類型（二）PCR技術的應用（一）PCR技術的主要類型1.反向PCR6.錨定PCR2.不對稱PCR7.原位PCR3.RT-PCR8.