医疗药品管理钠钙交换体基因稳定转染及药物筛选细胞模型的建立.docxVIP

医疗药品管理钠钙交换体基因稳定转染及药物筛选细胞模型的建立

材料与方法

实验材料

1.细胞系：选用人胚胎肾293细胞（HEK293），因其易于培养、转染效率高且生长迅速，适合用于基因转染实验。细胞培养于含10%胎牛血清（FBS）、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO?培养箱中培养。

2.质粒载体：含有钠钙交换体（NCX）基因的真核表达质粒pEGFP-NCX，该质粒带有绿色荧光蛋白（EGFP）标签，便于后续观察转染效果。同时准备对照质粒pEGFP-N1。

3.试剂：Lipofectamine3000转染试剂、G418抗生素、RPMI1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、EDTA、PBS缓冲液、细胞裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、抗-NCX抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗、ECL发光液等。

4.仪器设备：CO?培养箱、倒置荧光显微镜、离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、酶标仪、流式细胞仪等。

实验方法

1.细胞培养与传代

-将冻存的HEK293细胞从液氮中取出，迅速放入37℃水浴锅中解冻。

-解冻后的细胞转移至含10ml完全培养基的离心管中，1000rpm离心5min，弃上清。

-加入适量完全培养基重悬细胞，接种于T25培养瓶中，置于37℃、5%CO?培养箱中培养。

-当细胞融合度达到80%-90%时，进行传代培养。弃去旧培养基，用PBS冲洗细胞两次，加入1ml0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，37℃孵育1-2min，待细胞变圆、脱壁后，加入2ml完全培养基终止消化。

-将细胞吹打均匀，按1:3-1:4的比例接种到新的培养瓶中，继续培养。

2.质粒转染

-转染前一天，将HEK293细胞接种于6孔板中，每孔接种2×10?个细胞，使细胞在转染时融合度达到70%-80%。

-按照Lipofectamine3000转染试剂说明书进行操作。分别取2μgpEGFP-NCX质粒和5μlP3000试剂加入125μlOpti-MEM培养基中，轻轻混匀，室温孵育5min。另取5μlLipofectamine3000试剂加入125μlOpti-MEM培养基中，轻轻混匀，室温孵育5min。

-将上述两种溶液混合，轻轻混匀，室温孵育20min，形成脂质体-质粒复合物。

-弃去6孔板中的旧培养基，用PBS冲洗细胞一次，每孔加入800μlOpti-MEM培养基。然后将脂质体-质粒复合物逐滴加入孔中，轻轻摇匀，置于37℃、5%CO?培养箱中培养。

-转染6h后，弃去含转染复合物的培养基，加入2ml完全培养基继续培养。

3.稳定转染细胞株的筛选

-转染48h后，在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光表达情况，计算转染效率。

-更换含有不同浓度G418的完全培养基进行筛选。首先进行G418致死浓度的测定，将HEK293细胞接种于96孔板中，每孔接种5×103个细胞，分别加入不同浓度（0、200、400、600、800、1000μg/ml）的G418培养基，每个浓度设3个复孔。培养10-14天，观察细胞死亡情况，确定能在10-14天内杀死所有未转染细胞的最低G418浓度为筛选浓度。

-确定筛选浓度后，将转染细胞用胰蛋白酶消化，按1:10的比例接种到新的培养瓶中，加入含筛选浓度G418的完全培养基进行筛选。每3-4天更换一次筛选培养基，直至未转染细胞全部死亡，出现抗性克隆。

-用克隆环将抗性克隆挑出，接种到24孔板中继续培养，扩大细胞数量。

4.稳定转染细胞株的鉴定

-荧光显微镜观察：将筛选得到的稳定转染细胞接种于6孔板中，培养24h后，在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光表达情况，确认细胞中EGFP-NCX融合蛋白的表达。

-RT-PCR检测：提取稳定转染细胞和未转染细胞的总RNA，按照反转录试剂盒说明书合成cDNA。以cDNA为模板，进行PCR扩增。NCX基因的引物序列为：上游引物5’-ATGCCAGCCCTGCTGCTG-3’，下游引物5’-CTAGTTGCTGCTGCTGCTG-3’。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性