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如何分析强降解试验质量不守恒

强降解试验的目的并非是为了实现分析结果的质量平衡，而是对降解化学有一个比较全面的了解：

1）了解药物的降解路径及分子内稳定性；

2）建立稳定性指示分析方法，使其适用于样品检测；

3）为药品的处方、工艺、包装、贮藏条件的确定提供有益支持，以便于稳定性试验的顺利进行。在一些情况下，降解产物（杂质）质量（或摩尔数）的增加小于母体化合物（主成分）质量（或摩尔数）相应的减少。

问题的潜在来源和解决方法如下所述：

（一）降解产物在色谱柱上未被洗脱

假定母体化合物和所有降解产物都是完全可溶的，并且可以通过HPLC-UV检测。有以下方法可以诊断此问题：

（a）可以修改HPLC方法以洗脱其他杂质

可以通过增加流动相的强度（即增大有机相比例）或增加分析时间来修改HPLC方法，以洗脱保留较强的非极性化合物。

（b）可以使用紫外分光光度法将部分降解的样品与未降解进行分析，并将结果与通过HPLC分析获得的结果进行比较。

此方法对于使用UV检测器的HPLC方法很有用。由于紫外分光光度法不涉及分离，因此不会由于化合物保留在色谱柱上而被遗漏。使用这种方法，可以将部分降解的样品在流动相中溶解或稀释。获得部分降解样品完整的UV（或VIS）光谱，并将其与未降解样品的光谱进行比较。在HPLC方法中使用的波长下获得部分降解样品与未降解样品的吸光度之比。然后将该吸光度比与通过HPLC方法获得的部分降解样品与未降解样品的总峰面积之比进行比较。如果使用HPLC方法检测到所有杂质，则部分降解样品的总HPLC峰面积除以未降解样品的HPLC峰面积应等于吸光度比。如果HPLC方法利用光电二极管阵列（PDA）检测器，则可以根据需要在多个波长下确定比较。如果HPLC面积比明显小于分光光度法吸光度比，则存在一种或多种降解产物没有从色谱柱上洗脱。

（c）可以使用不接色谱柱的HPLC系统分析样品（即流动注射分析）。

在该实验中，用双通代替HPLC系统中的色谱柱，将获得的总峰面积与使用色谱柱时获得的总峰面积进行比较。如果在接色谱柱时获得的总峰面积明显小于不接色谱柱时的总峰面积，则HPLC方法中存在一些杂质未被洗脱。在不接色谱柱的情况下，所有杂质和主成分共同洗脱，得到一个未保留的峰，其面积与可检测物质的总量成正比例。假设所有物质都被洗脱，则色谱柱存在时所有峰的总峰面积应相同。如果色谱柱存在时与不接色谱柱时总峰面积差异较大，则在给定的色谱条件下很可能一种或多种化合物没有被洗脱。这种诊断方式的潜在困难是易受溶解样品溶剂的影响，若溶剂与流动相有很大不同，则溶剂对样品响应的影响可能会使在没有色谱柱的情况下难以进行准确的积分。此外，进样量产生的峰面积不能超出线性范围。最后，如果在使用色谱柱时使用了流动相梯度，则不断变化的溶剂组成会影响分析物的响应，从而影响洗脱物质的峰面积。当梯度流动相组成的每个极端值均等地使用时（等度），可以通过比较不使用色谱柱而获得的总面积来确定梯度是否具有这种影响。

（二）检测器未检测到降解产物

HPLC-UV是最常用的检测技术。尽管广泛适用，但紫外检测器不能检测所有化合物。降解可能会产生没有生色团的化合物，在这种情况下，观察到的降解产物增加量将小于母体化合物的损失量。该问题的诊断可使用更低的波长或使用其他检测器（例如，蒸发光散射检测（ELSD），带电气溶胶检测（CAD），质谱法（MS）或火焰电离检测（FID）。必须牢记的是，虽然此类检测器适用范围广，但与UV一样，其响应也不均匀。例如，蒸气压明显的化合物通过ELSD和CAD给出的响应较差，而MS响应随可电离性变化很大。但是这种检测器对于确认原始方法未检测到的降解产物的存在可能非常有用。

检测器未检测到降解产物的示例如候选药物LY297802。LY297802水溶液在冷白色荧光灯（约17000lux）下破坏3天，质量损失了5.4％；破坏7天，质量损失了42％。但是，通过HPLC-UV有关物质方法（梯度方法），降解产物的增加量分别为0.4％和1.3％，明显存在分析质量不平衡。仔细检查盛有样品的容器，发现表面沉积了不溶性雾状薄膜。收集该不溶性薄膜并通过EI-MS分析，表明该薄膜含有元素硫。由于硫很可能源自噻二唑环的降解，考虑生成没有生色团化合物的可能性，及形成挥发性产物的可能性。用己烷萃取（从轻度降解的水溶液中碱化，得到LY297802的游离碱），然后进行GC-FID分析，发现降解样品中有两种主要的降解产物。使用GC-MS进行分析，提供了分子式信息，阐明了结构，提供了对降解化学的了解以及HPLC-UV缺乏可检测性的原因（如，降解产物易挥发且无紫外吸收）。

在某些情况下，由于不溶性，挥发性或吸附损失，降解产物会无意中从检测样品中排除。通常，最难解决的问题是最明显且最直接的解决方法。在这种情况下，目视观察或浊度