DB54_T 0449-2025 藏猪副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌和胸膜肺炎放线杆菌三重实时荧光定量PCR检测技术规范.docxVIP

ICS65.020.30CCSB41

54

西藏自治区地方标准

DB54/T0449—2025

藏猪副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌和胸膜

肺炎放线杆菌三重实时荧光定量PCR检测

技术规范

2025-05-10发布2025-06-10实施

西藏自治区市场监督管理局发布

I

DB54/T0449—2025

目次

前言 II

1范围 1

2规范性引用文件 1

3术语和定义 1

4缩略语 1

5仪器和设备 2

6试剂和耗材 2

7样品采集和处理 2

8核酸提取 3

9三重实时荧光定量PCR检测 3

10结果判定 3

11生物安全措施 4

附录A（规范性）培养基及溶液配置 5

附录B（规范性）阳性质粒的构建 6

附录C（规范性）荧光定量引物、Taqman探针名称及序列 7

附录D（规范性）荧光定量PCR反应体系及条件 8

DB54/T0449—2025

II

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由西藏自治区农业农村标准化技术委员会提出并归口。

本文件起草单位：西藏农牧学院、江苏农牧科技职业学院、泰州市姜堰区三水街道畜牧兽医站、昌都市畜牧总站。

本文件主要起草人：罗润波、封琦、吴双、朱勇、韦创创、朱善元、商鹏、郑凯毅、普布扎西、赵红阳、李沛明、张辉、拜占春、韦明邦、李可欣、钟亚男、石斌。

DB54/T0449—2025

1

藏猪副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌和胸膜肺炎放线杆菌三重实时

荧光定量PCR检测技术规范

1范围

本文件规定了藏猪副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌和胸膜肺炎放线杆菌三重实时荧光定量PCR检测方法的仪器和设备、试剂和耗材、样品采集和处理、核酸提取、三重实时荧光定量PCR检测、结果判定、生物安全措施等要求。

本文件适用于藏猪肺部组织、鼻腔或上呼吸道气管分泌物中的副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌和胸膜肺炎放线杆菌的定性及定量检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

NY/T1948兽医实验室生物安全要求通则

SN/T4835实验室生物废弃物管理要求

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

实时荧光定量PCR

指在PCR反应体系中加入荧光基团、利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，实现对未知模板的定性及定量分析。

3.2

循环阈值

是每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

HPS：副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis）。

PM：多杀性巴氏杆菌（Pasteurellamultocida）。

APP：胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacilluspleuropneumoniae）。

BHQ1：黑洞淬灭剂-1（BlackHoleQuencher-1）。

DB54/T0449—2025

2

BHQ2：黑洞淬灭剂-2（BlackHoleQuencher-2）。

FAM：一种在荧光定量PCR中常用的荧光探针（FluoresceinAmidite）。

CY5：一种在荧光定量PCR中常用的荧光探针（Cyanine5）。

VIC：一种在荧光定量PCR中常用的荧光探针（ViewItCompounds）。

FBS：胎牛血清（FetalBovineSerum）。

NAD：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NicotinamideAdenineDinucleotide）。

ROX：一种惰性参比染料（6-Carboxy-X-Rhodamine）。

Taqman探针：一种双标记的寡核苷酸水解探针（TaqmanProbe）。

TE缓冲液：Tris-EDTA缓冲液（Tris-EDTAbuffer）。

TSB：胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TrypticaseSoyBroth）。

ddH2O：双