动物遗传学实验二、小鼠骨髓细胞染色体标本的制备与观察.pptVIP

*******实验二、小鼠骨髓细胞染色体标本的制备与观察第二部分细胞遗传学染色体技术的发展1920年提出；直到1956年，AlbertLevan和华裔学者蒋有兴应用秋水仙素和植物凝激素、低渗处理，才使该技术得到了实质性的发展和完善；20世纪70年代，出现了多种染色体显带技术，提高了染色体分析的精确性；20世纪80年代中期，荧光原位杂交、纤维切割及染色体涂染等技术的出现。使染色体细胞水平的研究与分子水平的探索衔接起来。染色体技术应用领域：临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学、特殊细胞的标记、杂种细胞的鉴定等。染色体技术应用意义：1.用于染色体组型分析；2.物种的特征及种属亲缘关系；3.分析物种的变异和进化过程；4.识别单染色体及基因定位；5.染色体疾病研究、肿瘤学研究及产前诊断；6.环境毒物、临床药物毒性检测。染色体技术的应用及其意义研究染色体的材料处于分裂旺盛期的组织：（1）动物的骨髓、外周血淋巴细胞、睾丸、羊水细胞等；（2）果蝇三龄幼虫的唾腺；（3）植物的根尖、花粉母细胞（如洋葱）。研究染色体的方法制片方法滴片法－－细胞培养材料、骨髓、羊水细胞等压片法－－果蝇唾腺、植物的根尖等{一、实验目的1、掌握动物骨髓细胞染色体标本制备的方法及操作技术，掌握细胞收集、低渗、滴片等技术手段。2、观察和了解小鼠染色体的数目及形态学特征。染色体上的基因决定了一个物种生长发育的全部信息。因此通过染色体分析，可以了解某一物种最基本的遗传指标。进行染色体标本的制备一般取自细胞分裂旺盛的组织，如骨髓。如将秋水仙素注射到动物的腹腔内，经肠系膜吸收并可转运到骨髓，结果使正在分裂的细胞不能形成纺锤体，使得染色体停在有丝分裂中期状态，再经过低渗、固定、滴片处理和制片后就可以清楚地观察到染色体。这种制片方法是属于侵害性的，因此这种方法适用于动物来源丰富、动物个体较小的材料。对于大型动物可以采取骨髓穿刺术获得红骨髓，在临床上用于一些血液疾病的研究分析。二、实验原理三、实验材料、仪器和试剂材料：小白鼠（25g-30g左右）。仪器：显微镜、注射器、10ml离心管、吸管、试管架、载玻片、恒温水浴锅、离心机、剪刀、磁盘、镊子等。试剂：20ug/ml秋水仙素、0.075MKCl溶液、磷酸缓冲液(pH6.8)、固定液（甲醇:冰醋酸=3:1)、Giemsa原液等。1、秋水仙素处理：取骨髓前2～3h，给小白鼠腹腔注射秋水仙素液（注射剂量为2μg/g小白鼠体重）四、制备步骤2、杀鼠取髓：采用脱颈椎法处死小白鼠。用剪刀剪开后腿上的皮肤和肌肉，取出股骨，剔净皮肉，再用剪刀剪掉股骨两端，用注射器分两次吸取KCl溶液（共5ml）通过针头注入骨髓腔缓慢将细胞冲入离心管，反复冲洗直到骨髓腔发白为止。注意事项：注射器剪掉剪掉3、低渗：将获得的骨髓悬液用吸管立即将细胞团吹散打匀，放入37℃恒温水浴锅内低渗20min。低渗结束时，向试管中加入加预固定液（甲醇：冰乙酸＝3:1，现配现用）8～10滴（约1ml），混合均匀（以防细胞结团），平衡（注意2管同时离心）后1000r/min离心10min，弃上清。4、第一次固定：在弃去上清液的试管中。加入新配的3:1甲醇冰醋酸固定液5~6ml，用吸管轻轻吸打均匀，37℃静置10min进行第一次固定。平衡后1000r/min离心10min，弃上清（可留0.5ml）。5．第二次固定：在弃去上清液的试管中。加入新配的3:1甲醇-冰醋酸固定液5~6ml，用吸管轻轻吸打均匀，37℃静置10min进行第二次固定。平衡后1000r/min离心10min，弃上清（留0.2ml左右）。6、滴片：在弃去上清液的试管中加入适量（2～10滴，在老师辅导下加）新配固定液，用吸管吹打均匀制成细胞悬液，滴2～3滴于冰冻的载玻片上，立即用嘴吹气使细胞迅速分散，在载玻片后面一角写上学号，空气干燥。7、染色：将染色体制片细胞面朝下反扣于染色板上，用1：19Giemsa稀释液染色10min，小水流自来水冲洗浮色，空气干燥后，显微镜下观察。五、骨髓法需要注意的问题1、秋水仙素的量一定要合适，太少分裂相少，太多染色体短粗。2、低渗时间一定要严格20－21分钟！加预固定液8滴（1ml左右），混