动物遗传学实验六、聚合酶链式反应（PCR反应）.pptVIP

实验六聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片段一、实验目的和要求1.学习和掌握聚合酶链式反应（PCR）扩增的原理和操作方法，理解PCR基因扩增技术在DNA操作中的重要性；2.了解影响PCR反应的因素和优化反应的条件。二、实验原理聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）简称PCR技术，是1983年，美国科学家K.B.Mullis发明的一种体外快速扩增特定基因或DNA序列的一种方法，是最常用的分子生物学技术之一。目前它在分子克隆、目的基因检测、遗传病的基因诊断、法医学、考古学等方面得到广泛的应用。PCR技术实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，大量扩增位于两段已知序列间的DNA区段。典型的PCR反应由高温变性、低温退火、适温延伸3步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。①模板DNA的变性：在高温（通常为93～95℃）下，使待扩增的模版DNA双链DNA变性分解成单链。

②模板DNA与引物的退火(复性)：温度降至55℃（37～65℃）左右，人工合成的引物分别与模板DNA单链的互补序列配对结合，形成部分双链。两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；

③引物的延伸：耐热的TaqDNA聚合酶在72℃下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，引物3’端为合成起点，按碱基配对与半保留复制原理，沿模板以5’3’方向延伸，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。如此反复进行，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每次循环使两条人工合成的引物间的DNA特异拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109以上，实际上一般可达106～107倍。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR技术的主要步骤：基因扩增示意图：PCR反应系统的组成主要包括：1.模版2.引物3.dNTP4.TaqDNA聚合酶5.缓冲液1.模版：模版DNA就是待扩增靶DNA序列，也简称为靶序列或目的DNA片段。模版的种类：模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子，可以是线状分子，也可以是环状分子。就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度。模板量过多则可能增加非特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率；对于模版的用量：基因组DNA：50～100ng；质粒：5～10ng模板变性温度：是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR就不会启动。一般变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而较少产量。一般取90～95℃。2.引物：引物是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的5’端决定扩增产物的两个5’末端位置。引物的浓度：PCR反应中引物浓度一般在0.1～1μmol/L之间，不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体，二是容易产生非特异性产物；低浓度引物经济而且反应特异性较好，但浓度过低，不足以完成30个循环扩增，则会降低PCR的产率。引物退火（复性）温度：温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异产物增加。一般退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：

Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)

Ta值（复性温度）=Tm值-(5～10℃)

引物的设计：1.引物长度约16～30bp，最佳长度为18～21bp。太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高，太长扩增效率下降；2.引物的组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体，两个引物中（G+C）含量应尽量相似,一般（G+C）的含量在45～55%，解链温度（Tm值）高于55℃3.四种碱基随机分布，在3’端不存在连续3个G或C，这样易导致错误引发；引物3’端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆动产生的不配对；4.引物内部尤其在3’端应不存在二级结构，如发夹结构。5.两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端，即使无法避免，其3’端互补碱基也不应大于2个碱基，否则易生成“引物二聚体”；两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性